[发明专利]细胞系、复制狂犬病毒的方法及定量检测该病毒的方法

说明书

本发明涉及一种持久性细胞系、一种复制传染性狂犬病毒的方法，以及利用该细胞系通过致细胞病变效应(CPE)定量检测该病毒的方法，以及检测狂犬病毒复制抑制物的方法。

为了产生蛋白质和病毒抗原需要有存活的细胞。在目前的技术状况下，当双倍体细胞株或持久性细胞系适用于产生所需的蛋白质或病毒抗原时，就把它们用于这个目的。与双倍体细胞株相比较，持久性细胞系具有表现出无限生长的优点，就是说它们是无限增殖化的。经过多次传代，这种持久性细胞株表现出细胞和抗原复制的持久特性，因为在这方面，它们并不象双倍体细胞株那样发生细胞的分化。除了双倍体细胞株的有限寿命(传代数)之外，这些细胞株的另一个严重缺点在于，需要作为双倍体细胞株原材料的器官、组织以及鸡胚并不能足量和随时供应。再者，原材料会潜在地和/或暗暗地受到污染(病毒、支体和细菌)，其结果是优化再现性抗原生产得不到保证。

我们知道，狂犬病毒可以在衍生自多种种类的细胞培养物中进行复制，而有关致细胞病变效应的文献非常少[Egert等人，病毒学记述33(1989)，353-358，Consales等人，病毒数学杂志27(1990)，227-286，Campbell和Charlton，见：兽医病毒学进展：狂犬病Kluwer专业出版物，Boston，Dordrecht，伦敦，1988]。致细胞病变效应(CPE)是一种由病毒所决定的特异性细胞破坏(胞溶作用)，可以在光学显微镜下容易地进行检测。

不过，一般来说，在没有任何CPE[Campbell和Charlton(1988)]或病毒决定的细胞病理变化下所进行的组织培养中，狂犬病毒复制仅仅是不规律的[Kaplan和Koprowski，狂犬病实验室技术，第3版，世界卫生组织专著丛书23，日内瓦(1973)]或者仅仅是瞬间出现的[Smith等人，交叉病毒学8(1977)，92-99]，因此在使用这些细胞株时，并不能通过对CPE的评估来可靠地检测狂犬病毒。

因此本发明基于提供无这些缺点的持久性细胞系及方法的技术问题，换言之，其通常可以使传染性狂犬病毒复制产量得以改善并出现CPE，可使用敏感性方式对其进行定量测定。

可通过权利要求中的实施方案来解决该技术问题。

我们惊奇地发现，在新型的持久性细胞系PH-2中，具有CPE的狂犬病毒的复制产量很高。来自不同病毒科的其它病毒种类(如微小RNA病毒、疱疹病毒、副黏液病毒、呼吸道肠道病毒和披膜病毒)也同样可以在该细胞系中进行复制。该细胞系适用于病毒抗原的生产和病毒及抗体的检测。特别令人惊奇的是，在该细胞系中进行复制时，属于杆状病毒的狂犬病毒总是产生CPE，因此该细胞系尤其适用于对狂犬病毒和(中性)狂犬病毒抗体的简易检测和定量测定。

因此，本发明涉及持久性细胞系PH-2和由其衍生出的细胞系。该细胞系PH-2保藏于位于Braunschweig的DSM Deutsche Sammlung furMikroorganismen(德国微生物保藏所)，号码为DSM ACC 2165。

在优选的实施方案中，本发明涉及具有CPE的狂犬病毒的复制方法，包括：用所要复制的病毒感染新型细胞系，在适宜的条件下进行温育，当其达到足够高的滴定度之后分离并提纯病毒粒子。

所使用的方法都是目前技术水平熟悉的，例如超离心法、超过滤法、层析法等等。可使用这些方法从由该方式所得到的病毒粒子中分离并提纯出病毒抗原，然后进行化学或物理裂解。可以使用由该方式所得到的这些抗原来制备疫苗或用于诊断目的。在更为优选的实施方案中，本发明还涉及获得狂犬病毒粒子的方法，包括：在获得病毒粒子之后，从病毒粒子中分离和提纯病毒抗原。

与使用目前技术水平所知道的细胞系相比，使用新型细胞系不仅可更有效地复制狂犬病毒并且能同时产生CPE，这使得用灵敏及简易的方法来检测样品中的狂犬病毒并定量测定成为可能。

而另外的优选实施方案涉及一种根据CPE来检测狂犬病毒的方法，其包括：将新型细胞系与怀疑含有待检测狂犬病毒的样品相接触，将细胞温育，通过在显微镜下测定CPE来检测所复制的病毒。为了实施该方法，例如可将病毒样品加入到种植在微滴平皿或其它细胞培养器皿(均为本领域技术人员所熟知的)上的细胞培养物中，可以搁置至实验最后或在与细胞培养基一起经一定吸附时间之后去除并用新鲜细胞培养基来代替。接种之后通过光学显微镜对该细胞培养物进行定时的CPE检测，如可在第5天至第7天时。