[发明专利]植物病原抗性基因及其应用

说明书

本发明涉及植物的病原抗性，更具体地说，涉及病原抗性基因的鉴定和应用。本发明是建立在对拟南芥RPP5基因克隆的基础之上。

植物总是处于潜在病原微生物的攻击之中。而农作物植物又特别脆弱，因为它们通常作为遗传均一的单种栽培体被培育生长；一旦受到疾病侵袭，损失可能是严重的。但是，大多数植物对大多数植物病原是有抗性的。为了保护自身，植物已逐渐形成了一系列预先存在的和可诱导的防御系统。病原体，特别是那些通过与活植物细胞的紧密关联而得到营养的活体营养性病原体。必须专门设法克服宿主的防御机制。如果病原体能够引起疾病，那么该相互作用被称为是相容的，但是如果植物是抗性的，那么该相互作用被称为是不相容的。品种特异性抗性与过敏性反应(HR)有非常密切的关系，这是一种诱导性反应，(推测)借助这种反应，植物通过在病原体企图侵入的位置使局部细胞死亡来遏制活的宿主细胞中的病原体。

很久以前就已知道，HR-相关的疾病抗性常常是(虽然不是绝对地)由显性基因(R基因)决定的。Flor曾表明，当病原体突变成能克服这种R基因时，这些突变是隐性的。Flor得出结论，为了使R基因发挥功能，必须在病原体内也存在被称为无毒性基因(Avr基因)的相应基因。为了变成有毒性的，病原体必须因而停止制造激活R基因依赖性防御机制的产物(Flor，1971)。一种通常被称为诱体/受体模型的，被广泛接受的实用假设是，只要病原体携带有相应的Avr基因，R基因则可编码使植物能够察觉该病原体存在的产物(Gabriel和Rolfe，1990)。然后，这种识别被转化成对防御反应的激活作用。

某些相互作用显示出不同的遗传特性。表达毒素(Hc毒素)的炭色长蠕孢(Helminthosporium carbonum)能感染缺乏Hm1抗性基因的玉米品系。失去Hc毒素表达的突变是隐性的，并与毒性丧失有关，这与基因对基因的相互作用相反，其中成为有毒性的突变是隐性的。1992年报导了一个显著的成就，通过标记分离了Hm1基因(Johal和Briggs，1992)。关于基因对基因的相互作用是如何从毒素依赖性毒性演化而来的论据，仍然是似是而非的。例如，其产物是毒素的靶的植物基因，可能突变成使植物对该毒素具有更高的敏感性，导致HR，并且使敏感性基因转变成抗性基因。但是，这似乎不是Hm1的作用方式，它的基因产物能使Hc毒素失活。

对于病原体无毒性基因的认识仍然很贫乏。几种细菌的Avr基因编码与其它类型蛋白质没有同源性的亲水性蛋白质，而另一些基因带有重复单位，其数目可以变更，从而改变它们在其中能表现无毒性的植物的范围(Keen，1992，Long和Staskawicz，1993)。为了使细菌的Avr基因诱导HR，需要其它细菌基因(hrp基因)，其病原性也需要其它细菌基因(Keen，1992，Long和Staskawicz，1993)。还不清楚为什么病原体要制造使植物能够察觉它们的产物。普遍相信，某些易弃去的Avr基因虽然有助于其病原性，但不是必需的，而其它一些Avr基因很少是非必需的(Keen，1992，Long等，1993)。对两种真菌无毒性基因的特征鉴定也有报导，暗黄枝孢(Cladosporium fulvum)如Avr9基因使试图攻击携带Cf-9基因的蕃茄变种的暗黄枝孢无毒性，该Avr9基因编码一种分泌性富半胱氨酸的多肽，其最后加工后的大小为28个氨基酸，但对其在相容性相互作用中的功能尚不清楚(De Wit，1992)。暗黄枝孢的Avr4基因编码一种加工后最后大小为106个氨基酸的分泌性多肽(Joosten等，1994)。

近年来，主要是基于遗传学准则的基因分离技术已取得了显著的进展，目前许多研究工作者正试图克隆各种R基因。

基于蕃茄Pto基因克隆的图谱已被报导，该基因能使蕃茄具有对丁香假单胞菌蕃茄致病变种的“基因对基因”抗性。(Martin等，1993)。对YAC(酵母人工染色体)克隆的鉴定表明，它携带有非常紧密地连接于该基因的限制性片段长度多态性(RFLP)标记。此YAC可用于分离同源性cDNA克隆。将两个这种cDNA与一个强启动子融合，在用于转化疾病敏感性蕃茄变种之后，其中的一个融合基因表现出能使此种蕃茄对携带有相应无毒性基因AvrPto的Pst菌株具有抗性。这两个cDNAs显示有相互同源性。的确，用Pto cDNA探针揭示了一个至少有6个成员的小基因家族，其中的5个可以在从中分离出Pto的YAC上找到，因此它确实含有这种根据对其它R基因座的遗传学分析推测的局部多基因家族。