[发明专利]以二肽基础的化合物生产的生物方法

说明书

发明背景

以二肽中间物为基础或至少部分为基础的化合物的大规模生产需要很容易以很低的代价获取大量的二肽中间物。实际上为此目的任何氨基酸的二肽都可以通过合成制备，但是合成二肽耗费时间，这将降低产品生产的效率并提高产品的价格。这些不利条件尤其对以二肽中间物为基础的化合物的大规模生产尤其重要。

发明概述

以下是生产二肽中间化合物的方法。这些二肽中间化合物由重组DNA技术生产，并从合成的DNA序列或自然产生的DNA序列中生产出来。这两个序列都编码含有特定重复二肽序列的蛋白质或多肽。这些二肽中间物通过酶解作用从大的蛋白质或多肽中释放出来，然后进一步加工以提供最终的化合物。发明详述

本发明描述了一个生产二肽中间化合物的方法。这些中间化合物进一步加工用以生产最终化合物。这些二肽中间物可以通过重组DNA分子的表达在重组宿主细胞中得到生产，这些重组DNA分子至少编码一个二肽中间物。重组DNA分子可以是合成的DNA分子或自然产生的DNA序列。编码二肽的DNA被克隆进一个表达载体，在重组的宿主细胞中表达。在宿主细胞中表达以后，二肽被纯化出来做进一步加工。在二肽被纯化以前，把二肽从更大的多肽中分离出来是必须的。含有二肽中间物的一个稍大的多肽可以含有多个二肽序列的重复或者二肽做为稍大蛋白质的一部分以一个或多个拷贝出现，此蛋白质可以含有不是二肽序列的氨基酸序列。二肽序列的重复可以用酶切或者化学切割的方法分成单个二肽。单个二肽可以纯化做进一步加工。

用于生产二肽的重组宿主细胞可以是能够表达重组DNA分子的任何宿主细胞。实际上适用于本发明方法的任何重组的宿主细胞对于本领域的那些技术人员是显而易见的，优选的宿主细胞包括，但不限于，细菌和真菌细胞，包括酵母细胞，适用于本发明的和现在商业上可以得到的细菌和真菌宿主细胞包括，但不限于，啤酒糖酵母，巴斯德毕赤酵母，大肠杆菌，黑曲霉，变青链霉菌，枯草芽孢杆菌。

用于表达编码二肽DNA的表达载体可以是适用于所选择宿主细胞的任何表达载体。这一点对于本领域的技术人员是显而易见的。优选的载体包括，但不限于，那些适用于细菌真菌细胞并包括酵母的载体。适用于本发明的细菌和真菌表达载体和目前商业上可得到的包括，但不限于在此所列出的。

通过使用酶在合适的位置切开多肽而不损害二肽中间物，把二肽从剩余的非二肽中分离出来或把单个二肽从二肽重复序列中分离出来。适用于本发明方法中的酶可以是商业上得到的或者由那些拥有适合酶活力的组织所产生的。合适的酶的选择依赖于所表达的特定的二肽序列。

二肽可以在它从多肽的剩余物或从二肽重复序列中分离之前或分离之后纯化出来。标准的层析技术适用于本发明的方法用以纯化单个二肽或含有二肽的多肽。标准的层析技术包括，但不限于盐分级分离。离子交换层析，大小排阻层析，羟磷灰石吸附层析，疏水相互作用层析。

通过在此描述的方法，得到的克隆DNA可以重组表达。此方法是把分子克隆进含有适合启动子或其它转录调控元件的表达载体，并转移进原核或真核宿主细胞以产生重组肽。此技术的操作在Sambrook J，等，supra中得到详尽描述，也是在本领域中熟知的。

在此定义的表达载体即这样的DNA序列，在合适的宿主中它可以转录克隆基因的拷贝，并翻译它们的mRNA。这样的载体可以在各种各样的宿主中表达真核基因，例如细菌，蓝绿藻，植物细胞，昆虫细胞，真菌细胞，动物细胞。

特定设计的载体允许DNA在宿主之间的穿梭，例如细菌-酵母或细菌-动物细孢或细菌-真菌细胞，或细菌-无脊椎动物细胞。一个合适构建的真核表达载体应该包括：一个在宿主细胞中自主复制的制备起点，选择性标记，限定数目的有用的限制酶切位点，一个有潜在能力高拷贝的有活力的启动子。启动子定义为这样的DNA序列，它能指导RNA多聚酶连结到DNA上并启动RNA的合成。一个强启动子即它能以很高的频率启动mRNA的合成。表达载体可以包括，但不限制于克隆载体，修饰的克隆载体，特定设计的质粒或病毒。