[发明专利]外流泵抑制剂

权利要求书

1.一种筛选非四环素特异性外流泵抑制剂的方法，包括在亚抑制浓度的抗菌剂存在时，确定潜在的非四环素特异性外流泵抑制剂是否抑制细菌的生长

其中所说的细菌产生一非四环素特异性外流泵。

2.权利要求1的方法，其中所说的细菌过量产生非四环素特异性外流泵。

3.权利要求2的方法，进一步包括比较过量产生外流泵的细菌与不能过量产生外流泵的另一种细菌的生长情况，

其中如果过量产生外流泵的细菌的生长比所说的第二种细菌的生长受到更大程度的抑制，那么该试验化合物为一非四环素特异性外流泵抑制剂。

4.一种筛选非四环素特异性外流泵抑制剂的方法，包括

在试验化合物存在和不存在时，将具有非四环素特异性外流泵的细菌细胞与被该外流泵运输的染料或荧光物质接触；和

比较该试验化合物存在和不存在时染料或荧光物质的胞内浓度；

其中该试验化合物存在时与不存在时相比，染料或荧光物质的胞内浓度升高表明该试验化合物为一非四环素特异性外流泵抑制剂。

5.权利要求4的方法，其中所说的染料选自龙胆紫和孔雀绿。

6.权利要求4的方法，其中所说的比较包括确定染料在悬浮培养基中的浓度变化。

7.一种筛选非四环素特异性外流泵抑制剂的方法，

包括确定在试验化合物和亚抑制浓度的第二种化合物存在时，在一表达非四环素特异性外流泵的重组细菌中，第二种化合物的胞内浓度是否升高，

其中所说的确定包括检测受第二种化合物浓度升高诱导的调控序列控制的报道基因的表达，和

其中如果该试验化合物存在时比其不存在时报道基因的表达水平更高，那么该试验化合物为一非四环素特异性外流泵抑制剂。

8.权利要求7的方法，其中所说的第二种化合物为抗菌剂。

9.权利要求8的方法，其中所说的调控序列受四环素升高的浓度诱导。

10.权利要求9的方法，其中调控序列为tetA调控序列，它含有一结合TetR的操纵位点。

11.权利要求7的方法，其中所说的报道基因表达一种酶。

12.权利要求11的方法，其中所说的报道基因为β-半乳糖苷酶基因。

13.权利要求7的方法，其中所说的报道基因提供比色报道。

14.一种试验外流泵抑制剂的方法，包括如下步骤：

a.将表达外流泵的重组微生物细胞与一试验化合物接触，和

b.确定在该试验化合物存在时，重组的微生物细胞是否生长，

其中当外流泵被抑制后比未被抑制时，所说的微生物细胞将生长更好，

其中如果该试验化合物存在时比不存在时所说的重组微生物细胞生长得更好，那么该试验化合物为一外流泵抑制剂。

15.权利要求14的方法，包括将该重组微生物细胞与一试验化合物，一诱导剂，和一高于该重组微生物细胞非诱导MIC的浓度的抗微生物剂接触，

进一步包括确定在试验化合物存在时诱导剂的胞内浓度是否升高，

其中诱导剂升高的胞内浓度诱导产生所说的抗微生物剂的灭活因子。

16.权利要求15的方法，其中所说的重组微生物细胞为重组细菌细胞，而所说的抗微生物剂为抗菌剂。

17.权利要求16的方法，其中重组细菌细胞含人工插入的DNA结构，该结构含一受该诱导剂升高的胞内浓度诱导的启动子，与一编码抗菌剂灭活因子的序列一起转录，

其中诱导剂升高的胞内浓度诱导编码抗菌剂灭活因子的序列表达。

18.权利要求17的方法，其中诱导剂诱导β-内酰胺酶基因的表达，而所说的抗菌剂为β-内酰胺。

19.权利要求18的方法，其中诱导剂为四环素，β-内酰胺酶基因为blaS基因，β-内酰胺为卡巴培南。

20.权利要求17或19的方法，其中启动子为tetA启动子，而重组细菌细胞表达tetR基因。

21.权利要求18或19的方法，其中β-内酰酶基因是染色体插入的。