[发明专利]通过扩环酶活性作用于青霉素G生产7－ADCA的方法

说明书

本发明涉及制备和回收7-氨基去乙酸头孢烷酸(7-ADCA)的生物合成方法。

β一内酰胺抗生素构成最重要的一类抗生素化合物，并具有悠久的临床应用史。这类抗生素中，突出的有青霉素类和头孢菌素类。这些化合物分别由丝状真菌产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和产黄枝顶孢(Acremonium chrysogenum)天然产生。

经过经典的菌种改进技术，使产黄青霉和产黄枝顶孢的抗生素生产水平比过去几十年大大提高了。随着对产生青霉素和头孢菌素的生物合成途径的了解增多和重组DNA技术的出现，现在有了改进生产菌株和将这些化合物体内衍生化的新工具。

β-内酰胺生物合成中涉及的大部分酶已得以鉴定，对其相应基因已进行了克隆，如见Ingolia和Queener的Med.Res.Rev.9(1989)，245-246(生物合成途径和酶)，及Aharonowitz，Cohen，和Martin的Ann.Rev.Microbiol.46(1992)，461-495(基因克隆)。

产黄青霉中青霉素生物合成的头两步是：三种氨基酸L-5-氨基-5-羧基戊酸(L-α-氨基己二酸)(A)、L-半胱氨酸(C)和L-缬氨酸(V)缩合成三肽LLD-ACV，然后该三肽环化成异青霉素N。该化合物含有典型的β-内酰胺结构。

第三步涉及通过酰基转移酶(AT)的作用以疏水侧链交换L-5-氨基-5-羧基戊酸的亲水侧链。如EP-A-0448180中所述，由AT介导的酶促交换反应发生在一种细胞器-微体中。

头孢菌素比青霉素贵得多。一个原因是一些头孢菌素(如cephalexin)是由青霉素经若干步化学转化而制得的。另一个原因是迄今只能发酵出具有D-5-氨基-5-羧基戊酰侧链的头孢菌素。在此方面迄今最重要的起始物头孢菌素C在任何pH下都非常易溶于水，这就意味着使用麻烦而又昂贵的柱技术进行费时费钱的分离工艺。这样获得的头孢菌素C须经若干化学和酶促转化才能转变为治疗用头孢菌素。

使用复杂的化学步骤使青霉素G发生扩环和衍生是目前工业上制备中间体7-ADCA的流行方法。生产7-ADCA所需的一个化学步骤5-元青霉素环结构扩环成为6-元的头孢菌素环结构(参见US4,003,894)。但这种复杂的化学步骤既昂贵又对环境有害。

所以目前急需用如发酵过程中的酶催化这类酶促反应取代化学方法。而用生物方法取代化学扩环方法的关键是头孢菌素生物合成途径中的中心酶-去乙酸头孢菌素C合成酶或扩环酶。

在一些实例中，人们发现来自细菌带棒链霉菌(Streptomycesclavuligerus)的扩环酶可在体外使青霉素环结构扩环(Baldwin等，四面体43(13)，3009，(1987))。在Cantwell等人的文章中(现代遗传学(Current Genetics)，17，213-221(1990))，描述了在产黄青霉中表达带棒链霉菌扩环酶。如该文中所示，在发酵过程中表达扩环酶并没有形成头孢菌素。又如Cantwell等人在Proc.R.Soc.Lond.B.248(1992)，283-289中所描述，只有当扩环酶和带棒链霉菌异青霉素N异构酶基因一起引入产黄青霉，才能观察到青霉素N(它的天然底物)的青霉素环结构转化为去乙酸头孢菌素C(它的天然产物)的头孢菌素环结构。已对扩环酶从生化和功能方面进行了充分表征(EP-A-0366354)，也对其相应的基因进行了表征。已描述了cefE基因的物理图谱(EP-A-0341892)和DNA序列，及cefE在产黄青霉中的转化研究。

扩环酶的另一个来源是细菌Nocardia lactamdurans(早期称为Streptomyces lactamdurans)。已描述了酶的生化特征和基因的DNA序列(分别见Cortes等，J.Gen.Microbiol.133(1987)，3165-3174及Coque等，Mol.Gen.Genet.236(1993)，453-458)。

既然扩环酶可催化青霉素N的5-元噻唑烷环结构扩环为去乙酸头孢菌素C的6-元二氢噻嗪环结构，这种酶自然成为取代化学方法扩环的合理的候选物。但不幸的是，这种酶只作用于头孢菌素生物合成途径的青霉素N中间体，而不作用于包括青霉素G在内的由产黄青霉产生的廉价易得的青霉素。青霉素N没有商业供应，而且即使经过扩环，青霉素酰基转移酶也不能轻易地将其D-氨基己二酰侧链除去。