[发明专利]包含蜕皮激素受体的基因开关

说明书

本发明涉及来自鳞翅目烟芽夜蛾(Lepidoptera Heliothis virescens)的昆虫类固醇受体及其编码核酸的鉴定和特征描绘。本发明还涉及这种受体和这种核酸的应用，特别是，但不限于，用于筛选方法，以及用于基因开关的应用。我们所述基因开关是指对所应用的外源化学诱导物具应答性(responsive)一种基因序列，该化学诱导物能够外部控制受所述序列控制的该基因的表达。

亲脂性激素如类固醇诱导基因表达的改变以引发对生长，细胞分化和体内平衡的深刻效应。这些激素识别享有共同模块结构的细胞内受体，这些共同模块结构包括3个主要功能域：包含反式激活域的可变氨基末端区，DNA结合域，分子羧基侧的配体结合域。该DNA结合域包含9个不变半胱氨酸，其中8个参与锌配位体以形成双指状结构。在核中该激素受体复合体结合于称为激素反应元件(HREs)的特异性增强子样序列以调节靶基因的转录。

由于第一类固醇受体成员基因的克隆和初步特征描绘，在最近3年昆虫类固醇研究领域已发生了一场革命。这些发展提示，试图使用这些知识以改进我们在针对昆虫害虫的长期斗争中的工具的时间已经成熟。针对类固醇受体超家族的分子生物学进行的大多数研究基于黄猩猩果蝇(双翅目)上，参见国际专利出版物第WO 91/13167号，一些研究针对天蛾和蜡螟(鳞翅目)。

自20-羟蜕皮激素首次被分离并显示参与昆虫发育的调节至今已30年。自那以后，进行了许多工作以试图阐明此憎水小分子调节多种活性的途径。到20世纪70年代早期，通过Clever和Ashburner的研究，已明确至少在3龄果蝇幼虫的唾液腺中，应用蜕皮激素导致一百种以上基因的可重复性激活。此途径中的蜕皮激素受体参与调节两组基因：一小组(早期基因)，被蜕皮激素受体诱导和一大组(晚期基因)，被蜕皮激素受体阻遏。早期基因被认为具有两种与蜕皮激素受体的功能互补的功能；早期转录的抑制和晚期基因转染的诱导。迄今已分离和特征描绘的早期基因成员属于具有类似于已知转录因子的特性的一组分子。因此预测它们能象蜕皮激素作用模型所预期的那样发生作用(Ashburner，1991)。更近期，早期基因E74和E75已显示结合两种类型的蜕皮激素可诱导基因(Thummel等，1990；Segraves和Hogness，1991)，因此支持他们推测的双重活性。然而应识别到，基因层次(gene hierachy)的激活不限于第三龄幼虫唾液腺，而是在许多其它组织中观察到在幼虫生活末期对蜕皮激素峰的反应，这些组织如器官芽(即转变为成虫结构的那些组织)和其它在幼虫生活末期组织溶解的幼虫组织(如幼虫脂肪体)。通过研究第3龄染色体疏松块推断的蜕皮激素作用模型不能应用于成虫中蜕皮激素调节基因的激活。换而言之，为了正确的发育表达，还需要除活性蜕皮激素受体以外的其它因子(例如，成虫中果蝇卵黄蛋白基因表达是在“两性”的控制下，即性别决定基因层次中的最后基因)。

脱皮激素受体和早期基因E75属于类固醇受体超家族。其它果蝇基因，包括超呼吸孔(ultraspiracle)、无尾(tailless)、七上(Sevenup)和FTZ-FI，也属于此超家族。然而，所有这些基因中只有蜕皮激素受体已知具有一个配体，因此其它的被称为“孤儿受体”(orphanreceptors)。有趣地，虽然超呼吸孔蛋白配体结合区与脊椎动物视黄X受体(RXR)配体蛋白享有49％共有性(Oro等，1990)，它们却不享有相同的配体(即，RXR配体是9-顺视黄酸(Heymann等，1992和Mangelsdorf等，1992)。上述所有果蝇基因与发育有关，例如超呼吸孔，为胚胎和幼虫腹部发育所需要。这些基因的蛋白产物均符合类固醇受体超家族的主要特征(Evans，1988；Green和Chambon，1988，Beato，1989)即，它们具有参与配体独立反式激活的可变N末端区域(区域A和B)，与DNA在特定位点结合有关的高度保守66-68氨基酸区(区域C)，被认为含有一个核转位信号的铰链区(区域D)，以及包含配体结合区，反式激活序列和二聚作用相的高度保守区(区域E)。最后一个区，域F，也非常可变异并且其功能未知。