[发明专利]以可溶性寡糖结合域为基础的分离和浓缩系统

说明书

技术领域

本发明涉及用聚合物配体对通过亲和相分离来分离和/或浓缩多肽和其它化合物的方法，其中配体与可溶性形成相的寡糖结合。本发明特别涉及一种相分离系统的应用，系统中包含可溶性寡糖，寡糖对以含有粪肥纤维单孢菌(Cellulomonas fimi)纤维素酶的纤维素结合域作为亲和配体的化合物有亲和性。

发明背景

通过蛋白质在微生物系统中表达来生产蛋白质已经成为极有价值的医疗上重要的蛋白质的来源。在发酵工艺设计中重组蛋白质的纯化和回收是主要的考虑因素。尽管可用常规的蛋白质纯化法来分离产物，但是最近，水性两相提取系统作为简化大规模纯化蛋白质产物(包括高剂量治疗药物如胰岛素和工业蛋白质如3-氧合类固醇异构酶、醇脱氢酶和果糖磷酸激酶)的手段已有相当高的工业价值。因此，现在有许多种可用于蛋白质纯化和细胞分离的两相系统。水性两相系统提取为大规模处理重组蛋白质和肽提供了独特的优点，包括高活性得率(即，较大的水性环境使纯化过程中的蛋白质失活最小)、可快速平衡、容易放大，最重要的是连续操作。

水性两相分配系统的技术可行性在一些高达100000升规模的系统中得到证明。它们是通过在水中加入两种水溶性的但不相容的聚合物或一种水溶性聚合物和一种强电解质来形成的。聚乙二醇(PEG)在许多工业两相系统中可作为一种聚合物组分，因为聚乙二醇价格低且有很宽的分子量组分可以采用。分级的葡聚糖，一种有α-1，3支链的α-1，6葡萄糖，通常作为第二种聚合物。然而，也可用其它许多水溶性聚合物，其中包括其它许多糖类聚合物。水性两相系统主要含有水，每一相富含一种诱导分离组分且几乎不含另一种。当将来自发酵液的蛋白质和其它生物大分子的混合物加入一个水性两相系统中时，每一种蛋白质根据它对于形成两相的组分的相对亲和力、大小、表面化学和净电荷来分配。

常规水性两相系统的分配系数较低和选择性较差促使了亲和分配系统的发展，它将各种常规分配系统的多用途性与亲和配体单一结合的选择性结合在一起。在许多场合，生物特异性配体是与形成相的聚合物，通常是PEG的一端或两端共价结合。相形成时聚合物的强分配使得配体聚集入一个平衡相中。高度不对称的分配与靶蛋白质与配体间的强亲和结合是亲和分离和浓缩的基础。

然而，尽管目前的亲和分配系统有一定的工业用途，但是由于每个聚合物链上只有一个或两个配体存在而导致了配体密度较低，因此它们的容量和分辨能力有限。由于聚合物浓度通常小于15％(重量)，因此配体与聚合物化学计量比为1∶1或2∶1的亲和分配系统中靶蛋白质的分离系数(与杂质的分离系数有关)在5至50之间。尽管这些分离系数足以满足产物浓度，但在低成本的一步或两步提取过程中它们通常也不能提供所需的产品纯度。典型的亲和分配系统也受到产生聚合物-配体共轭物的化学费用的局限。例如，配体与PEG的共轭反应首先需要用更活泼的亲电子试剂如溴化物、氯化物或环氧衍生物来取代末端羟基基团。然后第二步亲核攻击反应将聚合物和配体共价结合。配体聚合物的共轭物也必须设计成对每种待纯化的蛋白质或蛋白质类有特异性。

水性两相分离的一个新的进展是将水性两相系统与温度诱导相分离结合起来。至今为止，这些系统采用热分离聚合物作为顶相聚合物，葡聚糖或羟基丙基淀粉作为底相聚合物。温度诱导相分离在纯化步骤后，使得可以从生物产物中分离并回收聚合物。这种方式中的该方法有回收热分离聚合物的优点，但也有明显的缺点，即靶蛋白质对热分离聚合物没有独特的强的亲和力。将寡糖结合域技术用于这些两相系统可高效亲和分离含有与区域结合的聚合物的相，然后用简单的方法来回收并循环使用聚合物。因此有必要开发快速、廉价、高容量的方法来纯化所需的蛋白质，特别是通用的聚合物-配体共轭物的方法。

相关文献

为回顾形成相寡糖，参见Zaslavsky，“水性两相分配”Aqueous Two-PhasePartitioning，Marcel Dekker，Inc.：New York(1995)；Albertson，P.A.，“细胞颗粒和大分子的分配”Partitioning of Cell Particles and Macromolecules，3^rd ed.，Wiley Interscience：New York(1986)；Walter，H.Brooks.D.E.，和Fisher，D.，“水性两相系统中的分配”Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems，AcademicPress：orlando，FL(1985)。