[发明专利]抗日本脑炎疫苗的工业生产方法和所获得的疫苗

说明书

本发明涉及基于日本脑炎病毒(JEV)的预防日本脑炎的疫苗尤其是可用于人类的疫苗的生产方法。本发明还涉及由该方法所获得的疫苗。

在许多远东国家以及世界其它地区，传播媒介为蚊的日本脑炎病毒是导致已知为日本脑炎的严重感染的原因。

业已知抗日本脑炎的疫苗，它由将JEV颅内注射至幼年小鼠中并收集感染组织的方法来获得。接着通常通过沉淀方法，尤其是用鱼精蛋白沉淀来纯化所得到的组织悬液。在文献中还提到其它用于纯化这些组织制备物的方法，例如超滤、过滤和离心，或用聚乙二醇沉淀等方法，这些方法可相互结合或与凝胶过滤方法或硫酸纤维素或交联的硫酸多糖层析方法结合(JP-B-65,000,611，JP-A-53,133,627，JP-A-50,048,118，JP-A-2,223,531，US-A-4,725,546，JP-A-49,020,322和B-81,005,204，JP-B-67,025,408)。

在现有技术中，如世界卫生组织所建议，根据标准化方法，通过化学试剂如甲醛来灭活病毒制剂，由于病毒在该环境中更高温度下不稳定，所以在4℃下甲醛浓度为1/2000时长时间灭活50-60天。

由此获得的商业疫苗是有效的，但是其制备、纯化和灭活困难且昂贵。此外，由于来自幼年小鼠组织的污染物可能导致副反应，从而往往限制它们的应用。

因此希望能通过其它更工业化的方法，尤其是通过利用病毒在细胞系中繁殖和增殖来生产疫苗。然而，利用高度工业化的方法大量生产疫苗比颅内增殖的情况更为困难，这不仅由于必须处理相当大的数量，而且因为获得和控制高的产率很困难，还由于接着要遇到的，可能来自细胞或来自病毒增殖培养基的污染物所造成的纯化问题。现有技术已知日本脑炎病毒可在各种细胞培养物上繁殖，包括细胞系培养物，尤其是Vero细胞。然而，公开的培养方法不可能在大规模工业培养条件(仅以适当的成本生产)下获得满意的产率。现有技术中没有描述任何高度纯化来自细胞系繁殖和增殖的病毒制备物的方法。

因此本发明建议克服这些缺陷，并且提供抗日本脑炎的疫苗的生产方法，该方法可大规模及在安全、迅速和经济的条件下使用，并且可获得非常高纯度和非常好的工业产率的有效疫苗。

为了达到这些目的，本发明的主题是抗日本脑炎疫苗的工业生产方法，特征在于它包括下列步骤：

a)培养来自细胞系的细胞，

b)在存在病毒增殖培养基时，用日本脑炎病毒接种获得的细胞培养物，

c)病毒在细胞中繁殖和增殖。

d)收集细胞所产生的病毒悬液形式的病毒增殖培养基，

e)通过至少一个离子交换层析步骤和一个凝胶渗透步骤纯化病毒悬液，

f)将病毒悬液配制和转化成药物形式以保存至使用时。

根据本发明的具体特征，接种的病毒量相当于感染复数小于0.1。因此，对于病毒增殖和繁殖获得了良好的产率。

根据本发明的具体特征，该方法还包括在纯化步骤e)之前或之后灭活病毒悬液这一步骤。因此在使用毒性株用于病毒增殖和繁殖时，可以生产灭活的疫苗。

根据本发明的方法的特征，在室温使用化学试剂来进行灭活。因此可迅速进行灭活。

根据具体实施方案，该方法特征在于使用Vero细胞系以确保病毒增殖。由于这些细胞对日本脑炎病毒是非常相容的，因此可以获得良好的产率。

根据实施本发明另一特征，该方法特征在于通过进行下述步骤来纯化病毒悬液：

·离子交换层析，

·吸附层析，

·凝胶渗透。

因此可以获得很高纯度的疫苗。

根据本发明的另一个实施方案，该方法还在于在收集步骤(d)之后，再加入新的病毒增殖培养基，等待足够长的时间以允许进一步的病毒增殖和进行进一步的收集病毒增殖培养基。

因此可以从相同的细胞培养物中获得相当大量的收集物。

本发明的主题还在于通过在来自细胞系的细胞中的培养而获得的疫苗，特征在于它包括日本脑炎病毒，和细胞DNA含量小于100pg/剂。

从污染病毒和蛋白方面来看，该疫苗既具有功效又具有对可能与病毒接触的任何人进行全身性给药时所必需的安全性。

本发明的其它主题和优点将在阅读下面的描述时表现出来。

根据本发明，细胞培养可在发酵罐或按传统在烧瓶(Roux盘，旋转烧瓶，Multitray^TM，Cell-Cube^TM，等)中进行。