[发明专利]色谱纯化病毒的方法

说明书

本发明涉及病毒的纯化领域，更具体地说涉及纯化在细胞系中培养获得的病毒。

从细胞系例如Vero细胞中培养收集到的病毒不仅含有所需的病毒，而且含有来自于培养细胞的蛋白质和DNA。此外，当计划将病毒用于某种目的时，例如用于制备疫苗时尽可能地纯化是必要的。实际上，对于含从连续传代和异倍体细胞系获得的产品的疫苗而言，其中允许的细胞DNA最大限制量是100×10^-12克/疫苗剂量。

先有技术中已知病毒的纯化方法。例如，美国专利4,664,912特别公开了通过在蔗糖梯度中区带离心纯化狂犬病毒的方法。但是，这样的一种方法具有难于自动化完成的缺点；另外，必须有一个预先的失活步骤，该步骤可能导致病毒和细胞DNA之间相互作用，然后导致去除所述DNA更加困难。

该文献还公开了凝胶过滤步骤与离子交换色谱结合的纯化方法。但是，所述纯化方法不能够最大程度地去除细胞DNA。

本发明的一个目的是提供了用于非常高产量地纯化病毒的新的方法，该方法易于自动化。

本发明的另一个目的是提供了能够获得完整的，未降解的病毒的纯化方法。

为了达到所述目的，本发明的一个主题是从细胞系培养物获得的病毒进行纯化的方法，该方法包括通过离子交换色谱将病毒与来源于培养物的细胞蛋白质和DNA分离，其特征在于包括至少一个阳离子交换色谱步骤和一个阴离子交换色谱步骤。

根据本发明方法的一个特定的特性，阳离子交换色谱步骤是在阴离子交换色谱步骤之后完成的。因此，与按与所述顺序的步骤相反进行的方法相比，该顺序获得了最大的纯化产量。

根据特定的实施例，本发明方法还包括金属螯合的亲和色谱步骤。因此，能够真正地将残留的DNA的量降低到最小。

根据另一个优选的实施例，本发明方法还包括所有的色谱步骤在相同的pH值完成。因此可以使该方法自动化，并且在保持其效果的条件下大大降低其成本。

通过阅读下面的详细说明书能够更好地理解本发明。

本发明方法纯化的病毒是借助于细胞系，特别是连续传代的和异倍体的细胞系获得的病毒，所述的病毒趋向于与细胞DNA结合。这些病毒特别是狂犬病毒，日本脑炎病毒或流感病毒。这些要纯化的病毒可以通过在微支撑物上的非洲绿猴肾异倍体细胞中培养获得。例如通过培养获得狂犬病毒，如美国专利4,664,912中所述。

将这些病毒培养物过滤，然后根据本发明，通过阴离子交换色谱和通过阳离子交换色谱对病毒进行处理。

阴离子交换色谱可以是弱离子交换色谱，例如利用含有二乙氨基乙基的凝胶：由Sepracor出售的DEAE Spherodex凝胶，由Pharmacia出售的DEAE Sepharose凝胶，由E.Merck出售的EMD DEAE凝胶进行。虽然不经常用于去除核酸，但是优选的是利用强阴离子交换剂例如下列凝胶之一：由Bio-Rad出售的高Q凝胶，由Pharmacia出售的Q Sepharose凝胶，由E.Merck出售的EMD TMAE凝胶进行。

所有这些凝胶可以在Tris缓冲液中或在磷酸盐缓冲液中使用。优选的是，使用具有最大可能获得阳离子基团的凝胶，如对于E.Merck出售的EMD DEAE，具有15-25个单位的下列通式单体的链：

CH₂＝CHCONH(CH₂)₂N⁺(CH₃)₃

类似地，根据本发明的方法，优选的阳离子交换色谱是利用具有最大可能与阴离子基团接近的凝胶进行的，如E.Merck出售的EMD SO₃，具有15-25个单位的下列通式单体的链：

CH₂＝CHCONH-C(CH₃)₂CH₂SO₃

也可以利用Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液平衡该凝胶。

根据本发明的一个优选的实施方案，阴离子交换色谱是在阳离子交换色谱之前进行的，从第一次色谱获得的洗脱液，任选地经过稀释之后，直接引入到第二个色谱柱。该操作顺序可以最大程度地去除获得的细胞DNA。

通过洗脱阳离子交换色谱柱获得的病毒悬浮液已经满足用于制造疫苗的病毒的纯度标准。