[发明专利]用于确定Rh血型基因型的诊断方法与试剂盒

说明书

                   发明背景

本发明涉及一种确定Rh血型基因型的方法。更具体地说，本发明涉及一种直接确定与D/D，D/d，和d/d状态相关的Rh接合性以及伴随的CcEe基因型的分子遗传学方法。

人红细胞Rh(恒河猴)抗原形成了在临床医学中最重要的血型系统中复杂的一种(参考文献1)。在Rh抗原中，D抗原免疫原性最强并以刺激同种免疫而著称。根据D抗原在其红细胞膜上的有无，个体依其表型分为RhD阳性和RhD阴性(也用d表示)亚型。 Rh D/d不相容性及母体对D抗原的同种免疫是新生儿溶血症的最常见也是最严重的原因(参考文献2)。受到严重影响的(贫血的)胎儿可能甚至需要子宫内输血，这是一种危险的侵入性治疗措施。其它常见且临床上重要的Rh抗原包括C，c，E和e(也统称为“非D”)抗原。虽然在Rh阳性或阴性状态分类中并未考虑这些抗原，但在美国遇到的胎儿/新生儿溶血症中，C，c，E和e抗原已成为相对较常见的原因。这是因为先期带有Rh致敏的移民家庭在目前Rh病案中占了相当大的比例。

所有这些Rh抗原或特异性归属于一非糖基化但棕榈酰基化的跨膜蛋白，称为RhD，C/c和E/e多肽家族(参考文献3-5)。两个有关的结构基因D和CeEe编码携带这些抗原的红细胞膜蛋白。尽管C/c和E/e被认为是等位基因的抗原产物，但D抗原没有血清学可检测到的对映的“d”抗原(参考文献6)。在大多数情况下，D-阴性表型伴随着D基因的完全缺乏。在极少情况下，d表型可由部分缺失的D基因或表达缺陷的静息D基因导致。

从遗传学来看，所有D和非D抗原都以常染色体共显性方式表达，且它们以八种不同的Rh单倍型，即DCe，DcE，Dce，DCE，dCe，acE，dce和dCE，整个遗传(参考文献6)。这些组织构架的频率不是随机的，而是随着人种群体的不同而明显不同。(见表1，在本文别处详细说明)。

Rh单倍型的结构基础在Fisher对从人群研究中收集到的遗传证据进行分类综合后并未立即显现出来(参考文献6)。许多年后，从不同角度提示RH基因座的组成包括1-3个结构基因的一些概念模型被提出来以解释Rh抗原的遗传(参考文献6-7)。两个不同形式的Rh cDNA的分离(参考文献8-12)提供了在分子水平分析这些模型必要的信息。Southern印迹和转录测序分析表明在Rh-阳性受检者中存在两个基因，D和CeEe(非D)，但在Rh-阴性受检者中只存在一个基因(CcEe)(参考文献12-14)。这个发现提供了支持Rh基因座双基因模型的强有力的证据(参考文献7)。虽然如此，基因组图谱与Rh单倍型构架间无相关性是可能的，因为无法分离极度同源的D和非D基因(参考文献12，13)。

历史上，主要受检测与识别红细胞膜上Rh抗原表达的方法的局限，Rh基因型的确定只能间接进行。这些血清学方法中使用了能识别Rh蛋白或其部分并能与之相互作用的抗体或其它化合物。例如，已鉴定出许多对特定Rh抗原有特异性的抗体。检测Rh蛋白和其它血型抗原的凝集反应方法在美国专利Nos.5,324,479，5,302,512，5,213,963，4,560,647，4,403,042，4,358,436，和4,148,607中均有描述。许多描述这些传统的凝集反应型检测的出版物均可购得，例如Walker RH等编的《技术手册》(Teckmcal Manual)，第11版，美国血库联盟，Arlingto，Virginia(1993)，其全部内容在此引入作为参考(参考文献15)。

这些传统的血清学方法的局限是它们只提供了有关表达蛋白的外形方面的信息，而不能确定受检者Rh抗原的分子结构或分子遗传组成。为了推知Rh基因的遗传，这些方法通常不仅需要受检者的血样，而且需要其他家庭成员的血样。而且，在分析胎儿的表型时，获取血样使用了具有潜在危险的方法，在该方法中胎儿对出血敏感并可能死亡。总之，所有这些传统方法作为诊断工具是有缺陷的，因为没有一种方法提供了能确定Rh基因型的任何手段。

有人建议用限制性片段长度多态性(RFLPs)结合血清学试验以提高对血型基因及其遗传的认识(参考文献16)。这个建议的严重局限是它需要研究不是血型基因本身而又与特异的血型基因紧密连锁的DNA标记。通常这样的仍需被鉴定的侧翼DNA标记不表现出与结构基因完全的连锁不平衡。因此，它们不能用于精确地确定Rh基因型。但可发展成为用于连锁分析的分子工具。