[发明专利]具有自主复制能力的负链RNA病毒载体

说明书

本发明涉及一种用于基因治疗的病毒载体。本发明更加特别地涉及一种负链RNA病毒载体。

对于用于人类和动物的基因治疗说来，疗效和安全性是非常重要的因素。尤其是，在存在有不容否认的可能性时，如基因可能被插到染色体DNA的非特异位点、重组病毒和致病病毒可能被释放入自然环境以及不能控制转染到细胞中的基因的表达水平等，尽管其疗效被公认，通过使用由病毒基因重组获得的“病毒载体”而进行的治疗还是必须十分小心地进行。

近来，进行了大量的使用重组病毒的基因治疗并且提出了很多基因治疗的临床方案。这些重组病毒载体的特征主要取决于衍生出所述载体的病毒的那些特征。

病毒载体的基本本质是一种通过利用病毒的感染性将目的基因转移到靶细胞的方法。本说明书中的“感染性”是指“病毒通过其维持对细胞的附着和融合到膜的能力而将其核酸等转移到细胞的能力”。与遗传操作以插入目的基因的重组病毒载体的表面相结合的是核壳和包膜蛋白等，其来自于病毒并使重组病毒具有感染性。这些蛋白使得能够将包装的重组基因转移到细胞中。这些重组病毒载体不仅可用于基因治疗的目的，而且可用于生产表达目的基因的细胞以及转基因动物的目的。

病毒载体被分为三类，包括逆转录载体、DNA病毒载体以及RNA病毒载体。

近日来，在基因治疗中使用得最频繁的载体是源自逆转录病毒的逆转录载体。逆转录病毒通过以下过程复制。首先，病毒感染一旦建立其通过利用其自身的逆转录酶作为至少部分的催化剂和其自身的RNA作模板产生互补的DNA(cDNA)。几个步骤之后，所述cDNA被掺入至宿主染色体DNA中，成为前病毒。通过源自宿主的依赖于DNA的RNA聚合酶转录前病毒，产生病毒RNA，其被由其自身的基因编码的基因产物包装成病毒颗粒。

一般，用于基因治疗等的逆转录病毒载体能将过程进行至前病毒的产生。但是，其为丧失其包装所需的基因的缺损病毒以致于其不由前病毒形成病毒颗粒。逆转录病毒例如鼠白血病病毒、猪白血病病毒、baboon丙型肿瘤病毒、人免疫缺损病毒、成人T细胞白血病病毒等。此外，迄今报导的重组逆转录载体包括源自鼠白血病病毒[参见“病毒学”(Virology)，65，1202(1991)，“生物技术”(Biotechniques)，9，980(1989)，“核酸研究”(NucleicAcids Research)，18，3587(1990)，“分子和细胞生物学”(Molecular and CellularBiology)，7，887(1987)，“美国国家科学院院刊”(Proceedings of NationalAcademy of Sciences of United States of America)，90，3539(1993)，“美国国家科学院院刊”，86，3519(1989)，等]以及那些源自人免疫缺损病毒的那些载体[参见“临床研究杂志”(Journal of Clinical Investigation)，88，1043，(1991)]等。

产生逆转录病毒目的在于有效地将一个特异的DNA整合到染色体DNA中。但是，由于不能预料目的基因的插入位置，存在着不容否认的可能性，如损伤正常基因、激活致癌基因以及由于插入灭活过量或抑制表达目的基因。为解决这些问题，已研制出了利用可用作染色体外基因的DNA病毒载体的瞬时表达系统。

DNA病毒载体源于DNA病毒，病毒颗粒中有作为遗传信息的DNA。所述DNA的复制是通过以利用源于宿主的依赖于DNA的DNA复制酶作为至少一部分催化剂以自身作模板的产生互补DNA链的过程的重复来进行的。实际的利用腺病毒载体(一种可用作染色体外基因的DNA病毒载体)的基因治疗可以“自然遗传学”[(Nature Genetics)，3，1-2(1993)]中的文章为例。但是，由于在DNA病毒载体的情况下，产生不合乎需要的与核中染色体DNA的重组也是非常可能的，其作为基因治疗载体应非常小心地应用。

近来，已研究出基于RNA病毒的RNA病毒载体来作为可能比上述DNA病毒载体更为安全的载体。通过重复用于以其自身RNA作模板用其自身的依赖于RNA的RNA复制酶作催化剂产生互补链的过程来复制RNA病毒。