[发明专利]黑茶藨子启动子和基因

说明书

本发明涉及转基因植物产品和由遗传转化方法导入的基因序列的表达。本发明特别涉及黑茶藨子(Ribes nigrum L.)果实特异性基因启动子以及其在转基因果实的核酸序列的表达中的用途。

对果实成熟的分子基础的研究曾集中在果实表现出呼吸高峰成熟方式的种类上，例如蕃茄，鳄梨，苹果，猕猴桃，桃和芒果。这些种类的果实的成熟伴随着呼吸速率的突然增加，并且植物生长调节剂，乙烯的生物合成速率通常有大的增加。

无呼吸高峰果实则有着大不相同的成熟机制。无呼吸高峰果实的例子有越桔，黄瓜、葡萄，桔子和草霉。

果实成熟是一个重要的科研领域，对诸如蕃茄，猕猴桃和鳄梨的高价值的水果给予了特别关注。已分离并鉴定蕃茄的一些涉及成熟过程的基因，例如多聚半乳糖醛酸酶(一种作用于细胞壁果胶的酶)基因。已下调转基因蕃茄果实的多聚半乳糖醛酸酶基因的表达水平，结果导致果实硬度增加，从而储藏期延长(Schuch等人，1991)。

相反，关于无呼吸高峰果实的果实成熟的分子基础则了解得少一些。在导致本发明的工作中，本发明由测量呼吸速率发现黑茶藨子果实在成熟中不表现出呼吸高峰，并且成熟果实产生极低水平的乙烯，从而将黑茶藨子归类于无呼吸高峰果实。

黑茶藨子是欧洲最广为栽种的灌木果树，特别是由于其维生素C和花青苷色素含量高而受重视。黑茶藨子的改良的潜在领域包含增加色素水平，香味，风味，肉质，营养价值(如维生素含量)，储藏期，抗老化性，抗害虫或杀虫剂性，以及控制果实的糖、可溶性干物质或酸的水平。

通过导入相同或不同生物的基因或DNA序列能够产生具新/改良特性的植物。现在在关于已被用来驱动植物中外源基因的表达的植物DNA序列的文献中有很多实例。在大多数情况下，已将与基因编码区的5′末端相邻的区域用于基因构建体。这些区域被称为启动子序列。为产生新的表现型，必需有通过克隆到植物组织中活跃的启动子序列下游而导入的DNA的活跃表达。这些启动子可以是源于植物DNA或例如病毒的其它来源。在大多数情况下，多至500-1000个碱基的序列足以使得能够调节外源基因的表达。但是长于1kb的序列可能会有允许基因在转基因植物中高水平表达的有用特征。由诸如蕃茄的有呼吸高峰果实分离的果实特异性启动子的例子包括2All启动子和多聚半乳糖醛酸酶基因启动子。

对于研究遗传改良的黑茶藨子有相当的重要性的是在本发明的工作中发现黑茶藨子实际上是一种无呼吸高峰的果树。

启动子在其驱动的表达水平和组织特异性或发育阶段特异性的表达类型中会有变化。一些启动子以组织特异的或发育阶段特异的方式表达，而另一些则以各种方式在所有的细胞中表达并被称为组成型启动子。

使用最广的组成型启动子是花椰莱花叶病毒(CaVU)35S启动子，胭脂氨酸合成酶(nos)和章鱼碱合成酶(ocs)启动子。由于呼吸高峰和无呼吸高峰果实的成熟的分子机制不同，将从呼吸高峰果实如蕃茄分离的果实特异性启动子(例如2All启动子或多聚半乳糖醛酸酶基因)用于无呼吸高峰果实很难合适。

因而呼吸高峰果实特异性启动子可能不适于很多用来改良诸如黑茶藨子的理论上需要高水平果实特异性表达的无呼吸高峰果实的潜在的生物技术应用。在常规使用的组成型启动子的情况下，其缺点是在所有或几乎所有细胞型中并在植物的整个发育阶段驱动高水平的表达。由组成型启动子驱动的导入基因或DNA序列的表达会对正常的植物发育产生有害作用。另外，常规使用的组成型启动子是源于诸如植物病毒或农杆菌(一种土壤传染细菌)的植物感染剂。这些启动子的来源是关注对转基因植物产品的危险率估计的一个原因。

因此，本发明提供了启动子和用于获得能驱动转基因黑茶藨子和其它无呼吸高峰的果实的DNA序列的果实特异性表达的启动子的方法。该方法如权利要求1中所定义，并且该启动子如权利要求2中所定义。优选该启动子含有图9或文中称作RIBⅠ启动子的序列(IDSEQ)11中的或文中称作RIB7启动子的序列14中的核酸碱基序列。以前未报导有任何启动子适于驱动黑茶藨子和其他无呼吸高峰的果实的果实特异性表达。

本发明的一个优点是，由于表达的发育阶段特异性，即其提供在果实中高水平表达并且在其它组织中仅以极低水平表达，导入的DNA序列对正常植物发育有副作用的可能性减小。

本发明的启动子还优于一些组成型启动子在于其为源于黑茶藨子(人类食用的一种植物)的天然植物基因序列，而不是源于植物害虫或其它感染剂；这就克服了由于潜在的重组而对使用该序列的缺限。