[发明专利]一种脱毒工程菌及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学领域的一种工程菌，特别是涉及一种脱毒工程菌及其应用。

近几十年来，化学农药一直是园林农业中控制病虫草、鼠害的主要手段，其品种和销量逐年增加。化学农药在控制病虫草鼠害提高产量的同时，也破坏了生态，污染了环境，每年50万余吨的农药用量的70％将流入江河土壤，而且有的农药消解速度慢，空气中农药浓度将维持一个相当长的时间，并由于其残留对水域、食品的污染直接危害了人体健康以及动物的安全，污染的地表水又直接污染着地下水，正如伟大导师恩格斯教导的那样“人类正在承受着大自然所给予的报复”。而为确保粮食丰收，农药又是必不可少的，因此，脱毒、净化水资源，综合治理水环境污染刻不容缓，势在必行。

脱毒工程菌可用于降解被有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂污染的水源、土壤。国外有人已鉴定出耐药昆虫中与脱毒有关的酶类，然后从蚜虫中分离出控制该酶合成的基因，并将其克隆转入细菌中进行大规模培养，用于污水处理。但因其基因片段很小，故在细菌中的表达效率很低而没有应用价值。

本发明目的在于构建一种载有杀虫药剂解毒酶的高脱毒能力的重组质粒，并用这种质粒处理被有机磷、氨基甲酸酯、有机氯类酯化合物污染的水源和土壤，以期有效地治理水环境污染，拯救保护人类和人类赖以生存的地球。

本发明提供的脱毒工程菌如下：

从对杀虫药剂抗性的蚊虫中分离得到扩增500-800倍的酯酶基因，即酯酶B1，1.3Kb片段(序列见附图3)，并将其克隆到pRL-439质粒中，构建pRL-B1

重组质粒，再用新构建的pRL-B1重组质粒转化大肠杆菌(E，Coli HB101)，并在大肠杆菌中大量表达，制得带有含该重组体的酯酶基因的细菌，即为对有机磷，氨基甲酸酯，有机氯类酯化合物有降解作用一种脱毒工程菌。

其具体制备方法(参照附图1)：一、构建重组体pRL-B1质粒DNA：

1、煮沸法制备pRL-439质粒DNA(由P Wol提供，Ref.Gene，68：119-138，1988)取2ml在37℃振荡培养过夜的含质粒pRL-439的E.Coli HB 101菌液，离心收集菌体，加入700μl溶菌酶缓冲液，吹打混匀后加入17-20μl溶菌酶，沸水浴40秒。离心后吸去沉淀，上清用等体积酚，酚/仿，仿各抽提一次，离心收集上清，加入1/10体积3M NaAc，等体积异丙醇，-20℃沉淀30分钟。离心后用70％乙醇洗涤DNA沉淀，抽真空干燥后，用TE溶解即得pRL-439质粒DNA。

2、pRL-439质粒DNA酶解片段的分离回收

pRL-439质粒DNA用适量的E.coR1酶解完全后，在0.7％琼脂糖低溶点胶上电泳分离，于长波紫外灯下切下含2.7kb的DNA片段的琼脂糖低溶点胶，切碎后装入Eppendorf管中，在65-70℃水浴温5-10分钟，分别加入等体积酚，酚/仿，仿抽提，离心后收集上清，加入1/10体积3M NaAc，二倍体积无水乙醇沉淀；沉淀用70％乙醇洗涤，真空抽干，适量TE溶解即为2.7kb的pRL-439kb DNA片段。

3、煮沸法制备pUC-19 B1质粒

DNA(B1 in GenBank data base.accession no：M32328)取2ml在37℃振荡培养过夜的含质粒pUC-19的E.Coli HB 101菌液，离心收集菌体，加入700μl溶菌酶缓冲液，吹打混匀后加入17-20μl溶菌酶，沸水浴40秒。离心后吸去沉淀，上清用等体积酚，酚/仿，仿各抽提一次，离心收集上清，加入1/10体积3M NaAc，等体积异丙醇，-20℃沉淀30分钟。离心后用70％乙醇洗涤DNA沉淀，抽真空干燥后，用TE溶解即得pUC-19质粒DNA。

4、pUC-19质粒DNA酶解片段的分离回收

pUC-19质粒DNA用适量的E.coR1酶解完全后，在0.7％琼脂糖低溶点胶上电泳分离，于长波紫外灯下切下含1.3kb的DNA片段的琼脂糖低溶点胶，切碎后装入Eppendorf管中，在65-70℃水浴温5-10分钟，分别加入等体积酚，酚/仿，仿抽提，离心后收集上清，加入1/10体积3M NaAc，二倍体积无水乙醇沉淀；沉淀用70％乙醇洗涤，真空抽干，适量TE溶解即为1.3kb DNA片段。

5、pRL-439DNA脱磷反应