[发明专利]新型硫氧还蛋白可溶性表达载体及其融合蛋白

说明书

本发明涉及原核细胞中硫氧还蛋白融合蛋白的表达，特别涉及硫氧还蛋白结构类似物融合蛋白的表达。

最近McCoy等人(1993)将murine IL-2等多种细胞因子基因分别融合于大肠杆菌硫氧还蛋白(Thioredoxin)基因的C-端，结果发现这些融合蛋白在胞内能以可溶状态表达并能正确折叠获得与天然细胞因子相同或相近的生物活性，这一表达系统成功地解决了多种细胞因子在原核细胞中表达形成包涵体的问题。包涵体虽然有利于分离纯化，但需要进行复杂的复性，才能获得生物活性。Thioredoxin表达系统所表达的外源蛋白不需要复性就具有生物活性，但由于可溶性表达，给分离纯化带来了困难，并且表达产物是以Thioredoxin融合蛋白的形式存在。

本发明的目的在于获得一种适合于原核细胞表达的可溶性表达系统，由该表达系统表达的融合蛋白既可以避免包涵体的形成，而具有生物活性，又有利于分离纯化并能被特异水解，从而得到高纯度的重组外源蛋白。

本发明的目的可以通过以下技术方案得以实现。

通过在Thioredoxin活性位点(-Cys-Gly33-Pro34-Cys-)的Gly33-Pro34之间插入多聚组氨酸序列，获得Thioredoxin的突变体。在Thioredoxin突变体与外源蛋白的接头序列中设计水解蛋白酶特异切割序列，进一步获得既含有多聚组氨酸序列又含有水解蛋白酶特异切割序列接头的融合蛋白表达载体，通过该载体在原核细胞中进行外源蛋白的可溶性表达，表达的融合蛋白经柱层析分离纯化，经水解蛋白酶作用，得到具有生物活性的重组外源蛋白纯品。

通过在Thioredoxin的活性位点插入了多聚组氨酸序列，并在Thioredoxin突变体与外源蛋白的接头序列中设计了水解蛋白酶特异切割序列，使得通过该表达系统所表达的外源基因融合蛋白既不形成包涵体而具有生物活性，又有利于分离纯化和被特异水解，从而得到纯的外源基因蛋白。

附图说明：

图1为TrxAHis的基因序列。

图2为TrxAHisL的基因序列。

图3为融合基因表达载体PETTrxL和PETTrxHisL主要结构。

本发明的实施例是通过以下步骤得以实现。

一、大肠杆菌Thioredoxin(TrxA)基因的扩增

大肠杆菌Thioredoxin全长含108氨基酸残基，由位于基因组上的TrxA基因编码。根据已发表的TrxA基因编码序列，设计上、下游引物P1、P2上游引物P1长22个碱基(nt)，其3′-端12nt与模板互补，它包括ATG在内的前四个氨基酸残基编码序列，其5′-端设计有EcoRI和NdeI两个酶切位点。下游引物P2长45nt，其3′-端15nt中有14nt与基因的324nt-339nt序列互补，为避免引物内发夹结构的形成，第331nt-333nt位TTG由其简并密码TTA替换，另外考虑到构建融合表达载体的需要，在设计的下游引物中取消了基因3′端原有的终止密码，而代之以(GlySer)3多肽接头及XbaI和BamHI两个酶切位点。

引物P1：

        Met Ser Asp Lys5′GGAATTCCATATGAGCGATAAA3′

EcoRI    NdeI

引物P2：5′AAGGATCCCTCTAGAACCAGAACCAGAGCCCGCCAGATTAGCGTC3′

BamHI   XbaI因为上、下游引物长度相差悬殊并且它们与模板也分别只有12nt和14nt互补，所以在作PCR反应开始两轮循环时，选择了较低的退火温度，经循环扩增得到了TrxA基因扩增产物。

二、TrxA基因的克隆

将TrxA基因扩增产物直接用Promega公司生产的PCR纯化Kit进行纯化，然后用BEcoRI和BamHI酶切，电泳回收酶切片段，与EcoRI/BamHI酶切并回收的载体(本实施例选用pUC19)片段连接，转化E.coli，筛选重组克隆。经进一步鉴定获得TrxA基因阳性克隆(本实施例为PUCTrx)。

三、大肠杆菌TrxA基因插入突变体的构建