[发明专利]探测蛋白质的改进方法

说明书

本发明涉及用一种检测系统测定含水流体，如尿液中，的蛋白质，该检测系统含有蛋白质致误指示剂和缓冲剂。在几种影响肾脏、呼吸和中枢神经系统的病理状态的诊断中，确定尿样中存在着蛋白质是很重要的。通常需要定性或定量地测定尿液中的蛋白质，尤其是与糖尿病或肾脏疾病的诊断有关时。尿液中与糖尿病有关的主要蛋白质是白蛋白，它是分析中最常用的蛋白质。

人们已经知道几种确定尿液中存在着蛋白质的方法。最方便的是以少量尿液浸湿一种吸收条，该吸收条以蛋白质致误指示剂和缓冲剂饱和过。蛋白质致误指示剂是含有可电离基团的pH指示剂，该可电离基团在蛋白质存在时，可被置换，产生可测定的颜色变化。该指示剂在pH发生变化时，会产生同样的颜色变化，所以，在检测系统中包括有缓冲剂很重要，藉此避免pH上升，因为这种pH的上升会使指示剂在无蛋白质存在的情况下发生颜色变化，而导致假阳性结果。

以蛋白质致误指示剂，如酚磺酞，的结合为基础的蛋白质测定方法，是相对非特异性的蛋白质测定方法，本发明包括使用一些竞争性抑制剂，以提高建立在蛋白质致误指示剂的结合基础上的方法的特异性。

美国专利第5187104号讨论了蛋白质测定方法中DIDNT染料的使用，并且提到将颜色促进聚合物与试剂联用。其中提到的特定聚合物有聚丙二醇、聚丙烯醚碳酸酯和聚乙烯醚，也提到了Bayer AG标明为KOK10002的聚醚碳酸酯、来自Bayer AG的1，6-二甲基-4-壬基酚的环氧丙烷和环氧乙烷加成物，其商品名为Fenoil D4030，以及来自BASF，标明为Lutonal ISO的聚乙烯醚。

美国专利第5124266号提到使用一种检测条检测尿液中蛋白质，该检测条包括吸水载体基质，其中含蛋白质致误指示剂和缓冲剂，以基于聚氨基甲酸乙酯的化合物处理之，以防止背景颜色出现，藉以提高检测条之敏感性。

Pugia等的美国专利第5424125号提到使用聚乙烯醇和聚乙烯羧酸作为结合物，以防止缓冲剂由反应板流出。然而，没有人讨论过以下问题：能否用这些复合物加以提高或改变该方法对一种蛋白质相对其它蛋白质的特异性。

在1983年的Bunseki(32)379-386页中，Y.Fujiti谈到了在基于金属螯合染料的蛋白质检测中，使用聚乙烯醇。这篇文章谈到，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮适合作为单细胞形成过程中的非离子表面活性剂，但未提到对白蛋白特异性的提高。

关于长链烷烃对蛋白质致误指示剂结合蛋白质的影响，已开展了一些研究。长链烷基羧酸，如软脂酸，对蛋白质致误指示剂的结合的影响，已有Kragh-Hansen在1974年的Biophysics Acta(365)360-371页中论及。软脂酸酯对酚红与白蛋白的结合，显示出中度抑制效果，其它蛋白质没有被研究过。基于此，无法预料长链烷基能改变蛋白质结合的特异性。

其他研究表明，长链烷基磺酸，如十二烷基磺酸钠，影响蛋白质致误指示剂的结合。Marcart等在1984年的Clinica Chimica Acta(141)77-84页中，Perini等在1984年的Clinica Chimica Acta(143)321-3238页中发表的研究结果表明，十二烷基磺酸钠平衡了考马斯亮蓝(CBB)对几种蛋白质的敏感性的差异，并且降低了检测白蛋白的特异性。基于此结果，可以预料长链烷基能降低系统对白蛋白的特异性。

发明概述

本发明涉及含水测试样品中人血清白蛋白的半定量分析，通过将被怀疑含有该蛋白质的流体与检测试剂接触，该检测试剂包括一种蛋白质致误指示剂染料，该指示剂与蛋白质接触会产生可测定的颜色变化而完成。本发明公开了一种改进方法，它包括向检测试剂中加入竞争性抑制剂，抑制剂可用以下化学式A表示：其中是一连接基团，A和B可以是一单键或氧原子。当A是氧原子，B是单键时，该聚合物为聚乙烯烷基酯；当A是单键B是氧原子时，聚合物是聚烷基丙烯酸酯；当A和B均为氧原子时，聚合物是碳酸酯；当A和B均为单键时，聚合物为聚乙烯烷基酮。R取代基为1-20个碳原子的直链、分支或环状的烷基，其中0-10个氢原子可被羟基取代。聚合物骨架包括重复的烷基或碳酸酯亚单位，如纤维素或葡萄糖胺这些亚单位可与非反应性封闭单位共聚合，通过连接基团连接到重复的聚合物亚单位上的烷基数可从10％到理论上的最大值90％。