[发明专利]一种人工授精生产的转基因动物及其制作方法

说明书

本发明涉及一种采用以精子作为外源基因载体，并采用人工授精的方法生产转基因动物及其制作方法。

目前，国内外尚无以精子作载体通过人工授精生产转基因动物，因为用这种方法生产转基因动物存在着外源基因在动物体内整合率低，并且经处理的精子很难达到人工授精对精子活力的要求，若用经携带外源基因处理后的精子进行人工授精，必将显著降低怀孕率和产仔率。

本发明的目的在于提供一种生产转基因动物的制作方法来提高外源基因在动物体内的整合率及被经过携带外源基因处理的精子的活力，从而降低生产转基因动物的成本，提高生产转基因动物成功率，适合在生产中生产转基因动物。

本发明转基因动物是一种携带了外源基因的动物。其制作方法为：采集精液→镜检活力→高速离心→吸出精清→精子悬浮于组织细胞培养液中→再高速离心→重复洗涤→加入肝素→加入外源基因→37℃水浴30分钟→加入复苏剂→镜检活力→人工授精或制作冻精→生产转基因动物。

本发明的特征之一：在与外源基因作用后的精液中加入自制的复苏剂，能明显地提高精子的活力。目前，国内外利用精子作载体通过人工授精生产转基因动物，试验费用很高，失败率极大，其主要原因是经过转基因处理的精子复苏后其活力只有0.2～0.5，精子活力也很难达到常规人工授精的要求，怀孕率、产仔率亦显著下降，这就是目前尚无人用人工授精方法成功地生产转基因动物的主要原因之一。复苏剂由精清组成，亦可加组织细胞培养液共同组成。加入这种复苏剂可使精子活力达到0.6～0.9。

本发明的特征之二：加入肝素并控制加入量。加入肝素能使被处理的精子获能，获能精子才能受精。不加肝素或加入量过低，不能使被处理过的精子获能，而肝素量加入过高，又可竞争性地抑制外源基因进入精子内。因此，加入肝素并控制加入量是提高转基因成功率的重要手段之一。加入肝素的最佳范围在5～15微克/毫升。

本发明的特征之三：加大外源基因的量，可明显提高外源基因在动物体内的整合率。由于加大外源基因的量，可降低精子活力导致生产转基因动物失败，至今无人使用。本发明的制作方法中特地在用外源基因处理精子后加入了自制复苏剂，解决了因加大外源基因量降低精子活力的问题。外源基因剂量的最佳范围为10～30微克/毫升，为常用量的10倍以上。

本发明的特征之四：加入大剂量的组织细胞营养液，反复充分地洗涤精子，以提高外源基因在动物体内的整合率。由于精清中含有抑制外源基因进入精子的抑制因子及降解外源基因的酶，因此，充分洗去精子表面的精清成分是提高外源基因在动物体内整合率的重要方法之一。组织细胞营养液适宜剂量为原精液量的100倍以上。

本发明的特征之五：控制乙二胺四乙酸(ED TA)的加入剂量来提高外源基因在动物体内的整合率。因为乙二胺四乙酸可以防止外源基因在动物体内的降解，但是加入过量会对精子产生毒副作用。本发明提出其最佳剂量范围是0.1～0.5毫摩尔浓度(PH7.5)。

本发明的特征之六：在对精子处理的全过程中，始终遵守“等温操作”的原则，最大程度地避免因操作过程中温度差异对精子活力的影响，以最大程度地提高精子活力。

本发明中所用的组织细胞营养液为SIGMA公司生产的F10

实施例：4号公羊(新疆细毛羊)采精量为1.8毫升，活力为0.9，密度为密，放入离心机，以800个离心力离心6分钟后，吸出精清冻于-20℃备用。将去掉精清的精子悬浮于10毫升的组织细胞培养液中(F10+5％BSA)进行洗涤，再次以1600个离心力离心5分钟。重复洗涤、离心，加入15微克/毫升的肝素，作用10分钟后，再加入40微克/毫升的外源基因(该实施例所用外源基因为人抗胰蛋白酶基因)，进行37℃水浴25分钟，加入复苏剂后镜检活力为0.8，密度为中，精液量为2.1毫升人工授精配种21只母羊生产转基因羔羊。以同样方法共人工授精新疆细毛羊母羊313只，产羔257只，产羔率82.1％，随机抽样检测152只羔羊，经斑点、Southern杂交检测得到阳性羔羊15只，阳性率为9.87％。