[发明专利]三倍体对虾育苗方法

说明书

—种三倍体对虾育苗方法，属于水产养殖技术领域。主要用来培育对虾养殖新品种。

在现有技术中，鱼类和贝类三倍体育种研究开发的较多，而且某些种类如太平洋牡蛎等已经进入大规模应用阶段，在美国已申请到专利。而对吓三倍体育苗只有本发明人单位的相建海于1990年跟美国的Clark合作，以锐脊单肢虾为对象，开展了虾类染色体组操作可行性的研究，当时仅在实验室内获得锐脊单肢虾的三倍体的幼体-蚤状幼体；另据报道青岛海洋大学的戴继勋等1991年在实验室利用温度和细胞松驰素B诱导中国对虾三倍体，结果也是只在实验室获得少量蚤状幼体。由于对虾夜间和凌晨产卵的繁殖习性，难以获得批量受精卵，故以往的实验都只能在实验室中用200-300个受精卵进行诱导，且仅育出少量的对虾无节幼体和蚤状幼体，而没有培育出幼虾，更不用说养成了，因此均未进入实用阶段。此外，利用染色体制片进行倍性和诱导率的检测费时费力，不适用于规模生产；利用细胞松驰素B作诱导剂毒性大，诱导过程复杂，生产成本高。

本发明的目的在于提供一种切实可行，能改变对虾繁殖习性，诱导工作在白天进行，诱导过程简便，诱导剂毒性低，成本低，工艺流程可操作性强，诱导率高，检测迅速，适于规模生产的三倍体对虾育苗方法，不仅能培育出幼虾而且还能将幼虾养殖成为成虾。

根据对虾的生理生态尤其是繁殖习性、光控和生殖学原理及6-DMAP以及流式细胞计的特点，针对已有技术中所存在的主要问题，本发明的基本构思是：利用调节、控制亲虾产卵的环境条件，促使对虾改变其产卵习惯，即由夜间产卵改成便于操作和把握开始诱导之零时的白天产卵，以便获得适时的批量受精卵，并用6-DMAP作诱导剂来诱导三倍体，用流式细胞计检测倍性以便能早期、迅速、准确地确定诱导率，从而实现发明目的。

本发明所述的三倍体对虾育苗方法，其特征在于该方法包括：(1)改对虾夜间产卵为白天产卵，(2)用6-DMAP作诱导剂诱导对虾三倍体，(3)将对虾胚胎或幼体、成体制成细胞悬液，用流式细胞计测定细胞中的相对DNA含量，进而确定对虾染色体倍性这样三个步骤。

上述的(1)改对虾夜间产卵为白天产卵其方法是：将卵巢发育至四期的亲虾蓄养在体积为3-6M³的养殖池中，7-19时用黑布遮挡光线，19时至次日7时则将黑布撤掉并用200-500Lux日光灯照射，养殖水温从11-13℃逐渐升至16-17℃，养殖水的PH值为7.9-8.3。

上述的(2)用6-DMAP作诱导剂诱导对虾三倍体，其方法是：将6-DMAP用海水配制成200-400μM的处理液，在亲虾产卵后8-20分钟，用孔径为140μm的尼龙网将受精卵收集起来放进处理液中浸泡8-16分钟，然后用海水洗卵2-3次，最后将卵放进孵化池中进行孵化。

上述的(3)确定对虾染色体倍性的方法是：取对虾精巢，在等渗液中研磨，以40μm筛绢过滤，制成浓度为10⁶细胞/ml，用PI染色，用流式细胞计测出单倍体的DNA含量，N_o，另将诱导得到的对虾胚胎或幼体、成体的组织在等渗液中研磨，以40μm筛绢过滤，制成浓度为10⁶细胞/ml，用PI染色，用流式细胞计测出单倍体的DNA含量N，以N/N_o确定染色体的倍性。

本发明的优点是：整个工艺流程只有三个步骤且可操作性强，容易掌握，能改变对虾的产卵习惯，白天产卵既便于操作，又能清楚地观察到产卵的全过程以便较准确地把握操作开始的零时并能获得批量的受精卵，用6-DMAP作诱导剂，不仅无毒性，费用低，而且诱导率可高达75％以上；利用流式细胞计检测不仅省时省力，而且能早期快速准确地确定诱导率。用本发明不仅能批量的育出三倍体对虾幼虾苗，而且能够养成，通过对比试验证明成活率可提高21.6％，比二倍体体长增加15％以上。

本发明的最佳实施例之一是：1993年5月在本申请人的试验场做的实验。将卵巢发育至四期的亲虾蓄养在体积为4M³的养殖池中，白天用黑布遮挡光线，时间为：7：00-19：00；晚上将黑布撤掉，用光照强度为200-500Lux的日光灯照射，时间为19：00-24：00-7：00，养殖水温从12℃逐渐升到16.5℃，养殖水PH值7.9-8.3。