[发明专利]梳式斑点免疫检测法

说明书

本发明涉及人类免疫缺陷病毒HIV₁₊₂型抗体检测法，具体是一种梳式斑点免疫检测法。

国际上检出艾滋病的方法有多种如：间接ELISA测定法、直接FIA测定法、免疫印迹法测定法、Biochrom测定法、IAF Biochem测定法、Pharmacia测定法等[AIDS.1990 Apr；4(4)：355-60]。其中以合成多肽作为艾滋病的诊断试剂，因其肽是通过纯化学法合成，不引入任何污染抗原，具有高特异性和高敏感性等优点，是很有发展前途的一种诊断试剂[国外医学：预防1989，12(5)，193-195]。95年美国Schwartz-DH等叙述各种商用HIV抗体诊断试剂盒对测试的血清样品，其HIV感染的检出是100％的灵敏，Murex Single应用诊断系统和UntiedBiomedical公司的HIV-1/2酶免疫测定(ELA)试剂盒检出HIV_-1gp41的抗体的专一性达98～100％[Clin-Diagn-Lab-Immunol.1995 May；2(3)：268-71]。94年西班牙Fernandez-Rodriguez-E等叙述使用快速诊断免疫酶测定(测试包为HIV₁/HIV_-2)，在唾液里检出HIV抗体，此法对静脉药物泛用的人群意义尤为重大。文献叙述了从70名艾滋病患者的血清和唾液里，均能用此法同时和预期测量抗-HIV抗体[Rev-Clin-Esp.1994 Jul；194(7)：523-5]。

国内：中国发明专利CN 1052310是美国病毒技术公司在90年10月在中国申请的专利，文中叙述特异性肽片段HIVp17被用作检测和治疗艾滋病的诊断剂和疫苗。

本发明的目的是提供一种梳式斑点免疫检测法，用于检测血清、血浆或全血的HIV₁₊₂抗体。

本发明的上述目的是通过以下方式实现的：一种梳式斑点免疫检测法，包括将含HIV-1gp41和HIV-2gp36的人工合成多肽抗原色被于梳齿上，经与标本中存在的HIV反应形成抗原——抗体复合物，再与金标A蛋白作用，抗体阳性者梳齿尖即呈现红色斑点，阴性者无色。

本发明的优点是明显的，本方法通过特殊的合成肽，减少了非特异性反应；采用金标代替酶标，大大缩短检测所需的时间；使用梳条代替酶标板，无需任何设备，结果易于判断并可永久存档，而且灵敏度高达100％，特异性为99.9％；时间短，在20分钟可获得检测结果，所以适于临床、基层血站和落后边缘地区推广使用；另外，它适于长期存放，置于37℃可达二周，22℃三个月，4℃一年灵敏度，特异性不受影响。

本发明方法中采用的HIV-1gp41和HIV-2gp36合成抗原的纯度＞95％，溶解度≥1mg/ml，在浓度＜2μg/ml时有强的抗原性，HIV-1gp41和HIV-2gp36其序列分别为：gp41：Arg-Ile-leu-Ala-val-Glu-Arg-Tyr-leu-lys-Asp-Gla-Gln-lev-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-lys-lev-ile-Cys-NH2

gp36：AGln-Asp-Gln-Ala-Arg-leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Ary-Gln-Val-Cys-NH2。

A蛋白是一分子量42KD的多肽，是金黄色葡萄球菌S.aureus的正常膜组份。抗体分子有两个A蛋白的结合位点，位于重链的第二和第三恒定区。但是由于来源于不同动物的抗体以及不同的抗体型和亚型之间，其FC片断不同，因此A蛋白与不同抗体的亲合能力也不相同。A蛋白与来源于人、免、鼠的抗体具有很强的亲合力。

A蛋白与抗体FC片断的结合是通过疏水作用完成的，因此不会改变该抗体与抗原的结合活性。通过与酶、荧光素、胶体金等的结合，A蛋白可以用来对抗体进行定位或定量。

本发明使用的A蛋白，每mg可结合10-11mg人IgG。并具有如下的质量指标：

外观：肉眼观察为冰冻干燥粉未。

光吸收：在275nm光吸收，当10mg/mL浓度的A蛋白溶液A275≥1.32，样品光吸度(275nm)不低于此标准品的88％。

光谱特性：在250-350nm的光扫描图谱，其最大光吸收在275nm，最小光吸收在250nm，在267nm存在一个峰，在320nm的光吸收应小于0.04。

纯度：用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定为银染色单一条带(42KD)。

以下将结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例：梳式斑点免疫检测法