[发明专利]重组人淋巴毒素α衍生物a的构建与纯化工艺

权利要求书

1、一种重组人淋巴素养素α衍生物a的构建方法，包括从人基因文库中克隆人淋巴毒素α基因，从人T细胞cDNA文库PCR扩增得到编码人淋巴毒素α成熟蛋白的cDNA和引物设计、克隆、表达重组人淋巴毒素α衍生物a，其特征在于：

1)编码人淋巴毒素α成熟蛋白的cDNA核苷酸序列中第26位氨基酸是Thr；

2)PCR扩增重组人淋巴毒素α衍生物a cDNA的引物设计如下：

N端引物：5’ACA CAT ATG AAA CCG GCT GCT CAC CTG ATC GGA

C端引物：5’CCG AAT TCT ACA GAG CGA AGG CTC CAA AG

rhLTαDa cDNA与hLTα原型比较，N端缺失27个氨基酸，加上一个甲硫氨酸密码子，原第29位、33位和34位氨基酸的密码子CCT、CTC和ATT分别改为大肠杆菌偏爱的密码子CCG、CTG和ATC。

2、一种重组人淋巴毒素α衍生物a的纯化工艺，包括rhLTαDa包涵体溶解、复性和柱洗脱等步骤，其特征在于：离心收集菌体，并将其悬浮于8-15倍体积的Tris缓冲盐溶液TBS，TBS的配方为0.2mol/LNaCl,0.1mol/L Tris,50mmol/L EDTA,pH7.5；再经超声破碎，离心收集包涵体，重新悬浮于无菌水中，滴入0.1mol/L NaOH至悬液澄清后，再加40-60mmol/L的Tris-HCL缓冲液至溶液的pH值为9.0-9.5，复性后的样品过经40-60mmol/L Tris-HCl预平衡的DE52柱，40-60mmol/L Tris-HCl,pH9.0-7.0梯度洗脱，收集pH近7.0时的洗脱峰。