[发明专利]L-天冬氨酸的制造方法

说明书

本发明是关于用具有生成蓄积天冬氨酸酶能力的埃希氏大肠杆菌制造天冬氨酸酶的方法，和用天冬氨酸酶制造L-天冬氨酸的方法。

过去已有很多报告利用微生物生产的天冬氨酸酶，由富马酸和氨生产L-天冬氨酸的方法(特公昭54-12553号、特公昭57-18867号)。特别是用属于埃希氏杆菌属和棒状杆菌属的微生物，应用基因重组技术，获得天冬氨酸酶高生产株的试验(特开昭60-133883、特开平5-30977)。

为了用属于埃希氏杆菌属和棒状杆菌属的微生物高生产天冬氨酸酶，使用高价的富马酸作营养源，在应用基因重组获得天冬氨酸酶的高生产株中，为保持重组菌株的稳定性，使用了向母种培养基中添加抗生物质的方法。

在制造天冬氨酸酶时，使用了也能生产蓄积延胡索酸酶一类的微生物、制造天冬氨酸酶，当使用该天冬氨酸酶制造L-天冬氨酸时，可知利用延胡索酸酶能生产出除L-天冬氨酸外的其它付产物、而降低了L-天冬氨酸的回收率。为防止回收率降低、在生产天冬氨酸酶之后，为去除延胡索酸酶的活性，必需进行热处理和酸处理[化学工学，第58卷，878页(1994)，特公开3-55103]。

为了用具有生成蓄积天冬氨酸酶能力的微生物高生产天冬氨酸酶，必需使用高价的富马酸作营养源。在应用基因重组获得高生产株的天冬氨酸酶中，为保持重组菌株的稳定性必需的母种培养基中添加抗生物质，从而产生问题是在使用该天冬氨酸酶制造L-天冬氨酸时，除得到L-天冬氨酸外，还产生其它付产物。

根据本发明提供制造L-天冬氨酸的方法，其特征是在培养基中培养具有生成蓄积天冬氨酸酶能力的埃希氏大肠杆菌，在由该微生物的对数增殖期的中期到后斯的培养阶段，溶氧浓度要维持在0-1ppm，使培养物中生成蓄积天冬氨酸酶，再从该培养物中采取天冬氨酸酶，将天冬氨酸酶的制造方法和用该制造方法获得的培养物、培养菌体或该菌体处理物作酵源，由富马酸和氨生成蓄积L-天冬氨酸。

根据本发明的天冬氨酸酶制造方法，降低延胡索酸酶的混入率，就能高生产天冬酶，使用获得的天冬氨酸酶，就能制造出含付产物极少的L-天冬氨酸。

作为本发明中所用的微生物，可使用具有生成蓄积天冬氨酸酶能力的埃希氏大肠杆菌或其它任何菌，最好使用高生成、高蓄积天冬氨酸酶的埃希氏大肠杆菌。

通常的埃希氏大肠杆菌具有生成蓄积天冬氨酸酶能力，例如可举出埃希氏大肠杆菌ATCC11303。

高生成、高蓄积天冬氨酸酶的埃希氏大肠杆菌，在具有生成蓄积天冬氨酸酶能力的埃希氏大肠杆菌中，实施通常的变异处理后，在氮为唯一源的培养基中作快速繁殖株，可获得L-天冬氨酸[APP1.Env.Microbiol.，48.1072(1984)]。作为高生产这种天冬氨酸酶的菌株，例如可举出有埃希氏大肠杆菌EAPc7、埃希氏大肠杆菌EAPc244、埃希氏大肠杆菌EAPc28、埃希氏大肠杆菌。

EAPc110、埃希氏大肠杆菌EAPc130(特开昭60-133883)、埃希氏大肠杆菌H-9183。

利用基因重组技术可取得高生产天冬氨酸酶的菌株。作为这样的菌株，如可举出有埃希氏大肠杆菌TA5003、埃希氏杆菌ユリTA5004、埃希氏大肠杆菌TA5005(特开昭60-133883)。

按照以下培养方法，培养具有生成蓄积天冬氨酸酶能力的微生物，使天冬氨酸酶生成蓄积，由该培养物中采取天冬氨酸酶，以此制得天冬氨酸酶。

作为本发明微生物的培养基，可含有微生物所需的碳源、氮源、无机盐类等，对该微生物能有效培养的培养基可使用天然培养、合成培养基中的任何一种。

作为碳源、最好是该微生物能获得营养成分的，可使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含这些糖的糖蜜、淀粉或淀粉加水分解物等的碳水化物、醋酸、富马酸、乳酸、丙酸等有机酸、乙醇、丙三醇、丙醇等醇类。

作为氮源，可使用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等各种无机酸和有机酸的铵盐、胺类、其它含氮化合物、及胨、肉的提取物、酵母提取物，玉米淀粉等物(ユ-ンステ-プリカ-)酪蛋白加水分解物、大豆粕及大豆粕加水分解物，各种发酵菌体及它的消化物等。

作为无机物，可使用磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。

培养中的通气搅拌条件对天冬氨酸酶的表达水准有很大影响。到对数增殖前期在需氧下进行培养，从对数增殖期中期到后期，必需移植到培养液中溶氧浓度为0-1ppm的通气速律快的培养基中，以减少延胡索酸酶的生成蓄积，可提高天冬氨酸酶的生成蓄积。