[发明专利]一种高效亲和膜色谱介质及其合成方法

说明书

技术领域

本发明是一种用于液相色谱分析亲和膜色谱柱用的高效亲和膜色谱介质及其合成方法。这种介质填充的亲和柱可以与高效液相色谱仪配套使用，对具有生物活性物质进行快速的测量；也可从组成复杂的样品中提取和制备一种或几种活性组分。

背景技术

近年来，随着生命科学、生物技术、药学以及医疗技术的日益发展，对活性生物大分子的分析、分离和纯化的要求也越来越高。对于生物大分子(如蛋白质、核酸等)的分析、分离和制备，通常所用的方法有液相色谱法、经典的亲和色谱法、高效亲和色谱法、高效膜色谱法以及美国博大Perseptive Biosystem公司于1992年推出的Perfusion Chromatography。

液相色谱法如今依然是分离和分析各种蛋白和肽类物质的主导技术。液相色谱选择性高、灵敏、易于定量，对于少量产物的制备，纯度、产率和活性均较高。但是，经典的高效液相色谱也有其局限性：压降过大，很难用于样品的大规模制备；一次分析周期过长，难于应用到在线分析中；同时这也限制了液相色谱的方法改进和优化研究；对于稀溶液中某种物质的选择性吸附，液相色谱也不能够实现。

亲和色谱是对生物大分子进行分离和纯化的最有效的手段，它具有特异性好、纯化倍数高等优点。经典的亲和色谱基质有琼脂糖、葡聚糖、纤维素、硅胶、聚酰胺、多孔玻璃及各种高分子聚合物。其中，琼脂糖是使用最早、应用最广泛的亲和介质，它具有生物兼容性好、结构均一及非特异性吸附低等优点，但由于琼脂糖是一种凝胶类物质，极易产生不可逆变形，即使通过交联增大强度，它所能承受的压力也极为有限，这大大的限制了它的应用。多孔玻璃等基质所能承受的压力较大，但多孔玻璃表面能够被利用来连接配基的活性基团太少。而且亲和色谱一次分析所需的时间较长，这就限制了它在对时间要求严格的在线分析中的应用，对它的改进有几个方向：一是将颗粒粒径减小，从而减小扩散路径，降低分析时间，使它成为高效亲和色谱。高效亲和色谱中常用的基质是机械性能较好的硅胶，但硅胶表面的硅羟基有部分离子性质，使得硅胶表面非特异性吸附较强，且硅胶所能耐受的pH值范围较窄；而且减小粒度的同时大大增加了操作压力，用这种方法来进行大规模的制备是不实际的。改良亲和色谱技术的另一个方向是膜色谱。膜色谱是对微孔膜或超滤膜的表面进行改性以达到选择性的吸附，膜色谱中样品分子的扩散路径短，可实现快速的分析；但是一般的膜色谱吸附容量低。膜色谱具有相对较大的横截面积和较小的高度，因此压降较低；但是由于床高较小，很难实现样品的完全吸附，因而降低了产率；而且膜体系床外体积的比率较高，增大了峰扩散。这些缺点使得膜色谱的分辨率较低。

用于Perfusion Chromatography的POROS系列色谱基质近乎完美，其骨架为孔径非常均一的聚乙烯二乙烯基苯，其表面覆盖一层多羟基亲水聚合物。以这种基质为载体的色谱过程大多可在30秒到5分钟之内完成。这种介质现在多用于离子交换色谱。这类基质的缺点是非常昂贵。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合于高效分析和分离的亲和膜色谱介质及其合成方法。由这种介质所制备的亲和膜色谱柱可与液相色谱仪匹配直接对蛋白、酶等大分子的含量和活性进行测定，一般只需用2～7分钟；而通常用来测量酶活性的ELISA法一般需用几个小时。由于这种用于高效液相色谱的膜亲和分析柱的色谱过程最短可在1～3分钟内完成，因而可以应用于在线分析。它还可应用于小量样品的制备，而且这种分析柱的成本只是POROS柱的五十分之一。

本发明提供的适合于高效液相色谱亲和膜分析柱用的膜介质，其特征是以木纤维复合膜作为基质，再固载化配基而得到的适于作分析和分离的亲和膜色谱介质。所固载化的配基可根据分析和分离样品的需要采用金属离子、三嗪染料或蛋白制备成金属螯合高效亲和膜色谱介质，三嗪染料或蛋白为配基的高效亲和色谱介质。

本发明的膜介质的合成方法包括下述步骤：

1.甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯进行自聚反应制得聚合物；

2.聚合物与木纤维素进行接枝反应制得纤维素复合膜；

3.复合膜进行开环反应；

4.配基固载化反应制成膜介质。