[发明专利]超声波诱导植物组织基因转移方法

说明书

本发明利用超声波处理将外源基因直接导入植物组织细胞内，是一种诱导植物组织直接基因转移的新方法，属生物工程技术领域。

植物基因工程的关键技术之一，是如何高效地将外源基因导入植物细胞，并再生出转基因植株，以用于作物品种改良，培育出高产、优质、抗病的新品种。然而，作为植物基因工程最重要对象的禾谷类作物(属于单子叶植物)如小麦、玉米等，恰恰又是基因工程技术应用的难点，其困难之处即在于基因转移。这是因为，多数植物基因转移方法只适用于以原生质体(植物去壁细胞)或带壁的悬浮培养细胞作为转基因受体，而对于单子叶植物由原生质体或悬浮细胞再生植株很困难。克服这一困难的办法是选用植物组织块(幼胚、愈伤组织、叶片等)作为转基因的直接受体，因为任何植物(包括单子叶植物)由组织块再生植株都是很容易做到的。这就需要发展有效的、能以植物组织块作为转基因受体的方法。

在现有的植物基因转移方法中，基因枪法是一种能以植物组织块作为转基因对象的方法[Sanford JC et al.Particle Sci Technol，19875：27]。该方法的基本原理是将DNA包裹于微小的金属钨或金颗粒的表面，在高压下使金属颗粒喷射，高速穿透受体细胞或组织，使外源基因进入受体细胞的核中整合并表达。该方法的优点是可以免去分离原生质体的麻烦，直接转化植物的各种外植体、愈伤组织以及胚性细胞系。该方法的缺点是转化效率较低，因为只有击中具有潜在再生能力的胚性细胞时才有可能获得转化植株；此外，仪器价格也比较昂贵。

WO专利91/00358提出利用超声处理诱导外源遗传物质进入植物带壁的悬浮培养细胞的方法。但是，上述方法未涉及利用植物组织块作为转基因直接受体。由于植物组织块是带壁细胞的聚集体，它不同于悬浮于溶液中的带壁细胞，因此，需要经过特殊的超声处理，才可以实现植物组织块的基因转移。

本发明的目的，是提出一种超声波诱导植物组织基因转移的方法，即利用脉冲型超声波处理，将外源基因导入各种植物组织块中，以用于作物品种改良，培育出高产、优质、抗病的新品种。

本发明提出的利用超声波诱导植物组织基因转移的方法，由下列各步骤组成：

1)植物材料组织块的预处理：

将植物组织块切成若干毫米见方的小块，以增加基因转移的效率；

2)制备缓冲液，缓冲液的pH值为6.5～8.5；

3)将外源DNA加进缓冲液中，外源DNA的浓度大于10μg/ml，以保证基因转移具有足够的效率；

4)将预处理过的植物组织块放入适当的容器中，再加入上述第3)步所得含DNA的缓冲液，缓冲液加入量一般应保证溶液液面没过植物组织块；

5)将超声波探头置于容器外壁上或伸入溶液中，开启超声波信号发生器。超声波为脉冲型，超声波作用时间为0.5～60分钟；声波频率为20K～5MHz；声强为0.1～5w/cm²；一个脉冲周期内，超声波作用时间为1～50ms，脉冲占空比为5∶0.1～5。

附图说明：

图1是pBI121质粒的物理图谱图。

超声波诱导基因转移的机理，主要是超声波的空化作用。所谓空化作用，就是液体中存在的一些小气泡在超声波作用下发生共振并伴随产生的一系列物理现象。如空化作用发生时，在空化中心会产生局部的高温高压，使得细胞壁产生局部的穿孔，细胞膜也产生局部和暂时的结构改变，即也造成一系列的穿孔效应，溶液中的DNA分子可以藉此扩散进入细胞。在高等植物的许多组织中，细胞间的通道里存在一些微小气泡，这些气泡在超声作用下将成为空化中心，从而对周围的细胞发生作用。由于这种气泡是普遍存在的，这就使得大量细胞都能感受到超声波的空化作用。

本发明提出一种新的利用超声波诱导植物组织直接基因转移的方法。由于此方法可以将外源基因导入各种植物组织块中，因此特别适合于单子叶植物的基因转移，特别是禾谷类作物的基因转移。该方法同时还具有设备便宜、操作方便和转化效率高(见实施例)等特点，因此，在植物基因工程中将有着广泛的应用前景。

本发明的实施过程中，待转移基因的植物组织块，在超声处理前，一般切成若干毫米见方的小块，以增加基因转移的效率。本发明使用的超声处理缓冲液，其成分为：氯化钠(浓度为15mmol/L)，柠檬酸钠(分子式Na₃C₆H₅O₇.2H₂，浓度为1.5mmol/L)，缓冲液的pH值为7.5。缓冲液的pH值过大或过小，都不利于DNA的稳定。缓冲液也可以采用植物组织培养液。