[发明专利]逆病毒基因转移载体PLJF及制备方法

说明书

本发明涉及病毒、变异或遗传工程，属于C12N7/00，15/00类，一种肿瘤免疫基因治疗用的逆病毒基因转移载体及制备方法。

恶性肿瘤基因治疗研究是目前国际上肿瘤防治研究的最前沿，它给人类从根本上征服癌症开辟了全新的途径。几年来，肿瘤的基因治疗研究发展非常快，美国NIH已公布进入临床实验的肿瘤基因治疗方案有40多个，在亚州目本的若干个肿瘤基因治疗方案也正在进入临床实验阶段。目前癌症治疗的传统模式：手术、放疗、化疗三大疗法已处于停滞状态，而提高机体自身抗肿瘤免疫基因疗法越来越受重视，并成为癌症治疗新模式研究的热点。国际上免疫基因治疗亟待解决的两大技术关键，即高效转导和高效表达载体导入基因在体内高效稳定表达两方面。

本发明的目的是提供一种高转导和高表达的PLJF逆病毒载体，并应用它将肿瘤坏死因子(TNF)基因导入TIL和人癌细胞中，发挥细胞因子杀瘤效应及激活和增强机体抗肿瘤免疫的能力，实现对消化系癌等恶性肿瘤的免疫基因治疗。

PLJF逆转录病毒转移载体的构建方法，包括应用基因重组技术、用生物工程产品的双链DNA、逆转入病毒、连接酶、内切酶，其特征是切割方法：用限制性内切酶，在37℃反应条件下、在Nco I和BamH I位点之间特异性切断DNA双链；并采用连接方法：用连接酶T₄DNA Ligase反应，将目的基因Neo^R-β4-TNF-α连接在上述限制性内切酶BamH I和Noc I酶切切口之间，构成PLJF逆病毒载体。

本发明中比已公开的技术有所进展之处是，用基因重组技术构建高效表达人类肿瘤坏死因子TNF基因的PLJF逆病毒载体、得到高滴度病毒载体(10⁶CFU/ml)，并应用逆病毒中介基因转移技术将TNF基因导入胃癌组织分离的TIL细胞。

本发明的意义是提供一种构建这种基因转移载体的方法：以人类肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)基因为目的基因构建成高效转移及表达的逆病毒载体，然后采用逆病毒载体PLJF将目的基因导入TIL及恶性肿瘤细胞，使TNF在基因导入的细胞中得以高效表达，使细胞因子TNF在肿瘤局部维持高浓度及接种后激发局部及全身肿瘤细胞免疫功能，克服了全身用药时产生较强的毒副作用之缺点，从而最大限度地发挥TNF杀伤肿瘤细胞和激活机体抗肿瘤免疫的能力，实现对恶性肿瘤进行基因治疗的目的。在研究过程中经反复应用逆病毒载体向人癌细胞中的TIL细胞导入基因实验，探讨了提高基因导入率最佳条件，已达到对增殖细胞100％基因导入效率。应用逆病毒中介技术将Neo^R基因和TNF基因导入TIL和恶性肿瘤细胞并获得高活性高表达，其成功是肿瘤基因治疗的决定性因素，从而攻克了肿瘤基因治疗的技术关键。在国际上首先应用人胃癌肿瘤浸润淋巴细胞的肿瘤基因治疗研究。TNF基因导入人胃癌、肝癌、大肠癌细胞，及其抗瘤效果研究在消化系癌基因治疗上有重要意义。应用基因重组技术构建肿瘤坏死因子(TNF)重组子PLJF逆病毒载体，构建成的逆病毒载体及产生细胞具有高效转移和表达以及增强TNF活性之特征，在国际同类研究中具有特色。

实施例：

逆病毒基因转移载体的制备方法，即构建方法，包括用基因重组技术，其特征是在双链DNA的Nco I和BamH I位点之间进行特异性切割，再用连接酶将目的基因连接在切断的缺口中，构建成高效表达人类肿瘤坏死因子TNF基因的PLJF逆病毒载体。