[发明专利]杆状病毒全期启动子盒及含该全期启动子盒的载体系统

说明书

本发明属于昆虫杆状病毒的基因工程，具体涉及杆状病毒的全期启动子盒及含有该全期启动子盒的杆状病毒载体系统。

杆状病毒载体系统的建立和发展，是80年代真核基因表达研究领域的重大进展之一(Luckow & Summers 1988 Trends in the development of baculovirusexpression vectors Bio/technology 6：47-55)。与细菌、酵母细胞及哺乳动物细胞表达系统相比，这种无脊椎动物表达载休的最大优点是能高效(100-500mg/L)而广泛地表达外源基因产物。由于具有翻译后修饰加工系统，表达产物在大多数情况下，其抗原性、免疫原性和其它生物学功能都与天然蛋白质非常相似。因此，较高等的真核细胞内的蛋白质修饰、剪接及输送可在该表达系统内进行，这对于重组蛋白质是否具有生物学功能是必须的。此外，杆状病毒对脊椎动物或植物无致病性，使用安全。与哺乳动物表达系统不同，该系统无需用转化细胞或转化因子，操作更简便(O’Reilly，et al.1994 Baculovirus expression vectors A laboratorymanual New York，WH Freeman)。

常规的杆状病毒载体系统是建立在病毒复制最晚期高效表达的多角休(polh)基因可被外源基因取代这一基础上的。自Smith等1983年重组出第一个缺失多角体蛋白基因的苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus，AcNPV)以来，许多实验室相继构建了各种能取代AcNPV多角体蛋白基因的转移载体质粒。其主要策略是利用多角体(polh)基因的强启动子及其它一些基因元件，经细胞内同源重组，将外源基因片段引入野生型杆状病毒基因组，产生重组病毒，经过一系列的空斑筛选、纯化得到重组病毒。这条路线已相当成熟，且一直沿用至今，而近几年发展起来的几种新策略，极大地提高了重组效率，如线性化杆状病毒基因组(Kitts，et al.1990.Linearzation ofbaculovirus DNA enhances the recovery of recombinant virus expression vectors.NuclAcids Res 18：5667；Kitts，et al.1993 A method for producing recombinant baculoviruscxpression vectors at high frequency.Biotechniques 14：810-817)：酿酒酵母中YAC介导的重组(Patel，et al.1992.A new method for the isolation of recombinantbaculovirus.Nucl Acids Res 20：97-104)；大肠杆菌内转座子介导的重组(Luckow，et al.1993.Efficient genaration of infections recombinant baculovirus by site-specifictransporson-midiated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated inE.coli.J Virol 67：4566-4579)，以及体外位点特异重组等。上述各种用于操纵杆状病毒的策略，其共同之处是破坏了杆状病毒polh基因，重组病毒不能形成多角体(OCC)，因而在利用昆虫虫体表达外源基因方面显得极为不便(必须通过注射来感染虫体)。研究结果表明，在保留全部病毒基因的情况下，仅将另一拷贝启动子及与之相连的外源基因片段插入到polh基因或p10基因附近，由此构建的转移载体也能把外源基因重组至杆状病毒基因组中，并获得良好的表达效果(王珣章等，1991，形成多角体的杆状病毒载体系统的建立。病毒学报7：253-261；王珣章等，1992，人工合成杆状病毒后期启动子的探讨。中国科学(B辑)1：39-46：龙綮新等，1991，乙型肝炎病毒表面抗原基因在昆虫体系中的表达。生物工程学报7：37-46)。本实验室曾首次探讨了人工合成模拟杆状病毒后期启动子的方法，建立了既保留传统高效表达外源基因的特点、又形成多角体的重组杆状病毒体系(王珣章等，1991，形成多角体的杆状病毒载体系统的建立。病毒学报7：253-261：王珣章等，1992，人工合成杆状病毒后期启动子的探讨。中国科学(B辑)1：39-46)。此系统除可用作表达载体(可经口服大规模感染昆虫，免去注射感染虫体的麻烦)外，还因能形成多角体，可用于新型病毒基因工程杀虫剂的研制。