[发明专利]溶胶－凝胶包埋酶制备生物传感器的方法

说明书

本发明属于溶胶-凝胶包埋酶制备生物传感器的方法。

溶胶-凝胶包埋法是一种最新发展起来的固定化酶方法，它能在室温下实现溶胶-凝胶转变并同时包埋酶，从而有效地防止了酶和抗体等生物大分子的热失活，且制得的含酶胶膜具有物理刚性，化学惰性和抗微生物污染等优点。Bakul C.Dave et al.,Anal.chem.1994,66,1120公开了一种用溶胶-凝胶包埋酶制备生物传感器的方法，指出其主要优点是制备方法简单，酶活损失少且制得的含酶胶膜具有光透性，但此法制得的含酶胶膜很容易开裂，影响了生物传感器的重现性和稳定性。S.Sampath,O.Lev在Electroanalysis,1996,8,1112中将溶胶-凝胶固定化酶和碳糊电极的使用结合起来制备生物传感器，能够防止溶胶-凝胶的开裂，但此法所需的酶量很大，且每次使用前均需要重新抛光也不利于其实际应用。

本发明的目的是提供一种溶胶-凝胶包埋酶制备生物传感器的新方法，即将含酶的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶水溶液加入硅烷水解制得的溶胶中，混匀后直接滴涂于电极表面，室温放置一段时间，得到含酶胶膜不开裂且牢固粘附于电极表面的生物传感器，这样制备出的生物传感器响应快，重现性好，使用寿命长而所需的酶量少。

本发明将接枝度为5-30％的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成浓度为2-5％的水溶液，再将0.5-3.0毫克的酶，即葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、多酚氧化酶中的一种，加入300μl上述水溶液中，混匀，得溶液A；另取110-330μl 4-乙氧基硅烷，430-210μl水，即保证4-乙氧基硅烷和水的总体积为540μl，再加入20μl 0.1mol L^-1盐酸，60μl乙醇，混匀，超声振荡1小时后静置3-5小时，得溶胶B；然后将溶液A与溶胶B按3∶1-1∶3的比例混匀，用微量注射器移取5-10μl该混合液滴涂到基底电极表面，室温放置24小时，即制得所需的生物传感器。

本发明所述生物传感器的制备方法，在传统的溶胶-凝胶体系中加入了一种有机高分子-聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶，因而具有以下优点：1．聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶能自身物理交联成胶，又能通过聚乙烯醇支链上的羟基与溶胶-凝胶网络中的硅共价连接，从而防止了含酶胶膜的开裂，保证了生物传感器的重现性和稳定性；2．聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶可以通过氢键等相互作用稳定酶，减少了酶在溶胶-凝胶过程中的活力损失，有利于提高生物传感器的灵敏度；3．4-乙烯基吡啶支链在多种电极表面均有较强的吸附作用，能增强含酶胶膜在电极表面的粘附力；4．有机高分子的掺入改善了溶胶-凝胶膜的扩散性质，有利于含酶胶膜对底物的快速响应；5．本方法制得的含酶胶膜仍保留了传统溶胶-凝胶体系所具有的物理刚性、化学惰性和抗微生物污染等优点。

本发明提供的实施例如下：

实施例1．葡萄糖氧化酶电极。将接枝度为17.5％的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成浓度为2％的水溶液(聚乙烯醇为PVA-124，分子量84000)，向300μl此溶液中加入3毫克葡萄糖氧化酶，混匀，得溶液A；另取110μl 4-乙氧基硅烷，加入20μl 0.1mol L^-1盐酸，60μl乙醇，430μl水，混匀，超声振荡1小时后静置3小时，得溶胶B；再将100μl溶液A与100μl溶胶B混匀，用微量注射器移取10μl该混合液滴涂到玻碳电极表面，室温放置24小时，即制得葡萄糖氧化酶电极。该电极可用于水相中检测葡萄糖。电极平衡时间，5分钟以内；响应时间，10-12秒；线性范围，5×10^-6-1.5×10^-2 mol L^-1；稳定性，4个月以上。

实施例2：辣根过氧化物酶电极。将接枝度为5％的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成浓度为5％的水溶液，向300μl此溶液中加入0.5毫克辣根过氧化物酶，得溶液A；另取220μl 4-乙氧基硅烷，加入20μl 0.1molL^-1盐酸，60μl乙醇，320μl水，混匀，超声振荡1小时后静置4小时，得溶胶B；再将50μl溶液A与150μl溶胶B混匀，用微量注射器移取5μl该混合液滴涂于石墨电极表面，室温放置24小时，即制得辣根过氧化物酶电极。该电极可用于水相中检测过氧化氢，酚，胺等物质。电极平衡时间，5分钟以内；响应时间，8-12秒；稳定性，2个月以上。

实施例3：多酚氧化酶电极。将接枝度为30％的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成浓度为3％的水溶液，向300μl此溶液中加入1毫克多酚氧化酶，得溶液A；另取330μl 4-乙氧基硅烷，加入20μl 0.1mol L^-1盐酸，60μl乙醇，210μl水，混匀，超声振荡1小时后静置5小时，得溶胶B；再将300μl溶液A与100μl溶胶B混匀，用微量注射器移取8μl该混合液滴涂于玻碳电极表面，室温放置24小时，即制得多酚氧化酶电极。该电极可用于水相中测定苯酚，儿茶酚等物质。电极平衡时间，5分钟以内；响应时间，10-15秒；稳定性，2个月以上。