[发明专利]自积雪草的积雪草苷和羟基的积雪草苷和羧基积雪草苷的水溶性提取物及其分离方法

说明书

本发明涉及具有抗纤维化作用，能保护肝细胞的来自Centella asiatica的积雪草苷(asiaticoside)和羟基积雪草苷(madecassoside)的水溶性提取物和涉及其分离方法。

自生在非洲马达加斯加岛和印度的伞形科植物Centellaasiatica(L.)Urb，长期以来一直用于治疗局部创伤(Poizot.A，Dumez.D，CR.Acad.Sci[D]286，1978)。许多研究者报道Centella asiatica的定量(titrated)提取物(下文中称作“TECA”)对于组织的局部创伤有效。实际上，TECA为世所公认的药物并可买到，其商品名为“Madecassol”(积雪草苷∶积雪草酸∶羟基积雪草酸＝4∶3∶3)。其治疗效果为通过改善纤维化过程，保护组织细胞，以使损伤的组织恢复到接近原来的状态。但是，这些成分只限于治疗外伤，而且在韩国专利公开号第87-1458号、第87-1573号和第91-2518号中公开其提取需要复杂的过程，因而，其收率和纯度很差。此外，主要目的成分为配基(积雪草酸、羟基积雪草酸和崩大碗酸)和积雪草苷，它们都是不溶于水的，因而，限制了其用途。

尽管先存的TECA显示优越的抗纤维化作用，其不溶于水的物理性质迫使其自身以粉末形式使用，将其使用范围限制在治疗外伤。

由本发明者重复的，目的在于扩大TECA的药用用途的深入研究导致发现：用含水醇处理Centella asiatica，非常有助于提取溶于水并可有效地保护肝细胞和抗肝细胞纤维化的成分。

所以，本发明的目的为提供自Centella asiatica的积雪草苷和羟基积雪草苷的水溶性提取物，它显示优越的保护肝细胞和抗肝细胞纤维化作用。

本发明的另一个目的是提供所述水溶性提取物的分离方法。

根据本发明的目的，提供自Centella asiatica分离积雪草苷和羟基积雪草苷的水溶性提取物的方法，它包括如下过程：使包含Centella asiatica的含水醇冷冻沉淀；用卤化物溶剂处理含水醇中的提取物以便层离；用高级醇提取含水层；用氢氧化钠，然后用水洗醇层中的提取物并浓缩该提取物；用醋酸乙酯使该提取物结晶，得到结晶并洗结晶。

根据本发明的另一目的，提供自Centella asiatica的积雪草苷和羟基积雪草苷的水溶性提取物，它具有抗纤维化作用，能够保护肝细胞。

1.积雪草苷和羟基积雪草苷提取物的分离

使Centella asiatica浸入含水醇溶液中，得到提取物，然后，用卤化物溶剂处理该提取物。用醇(Cn≥4)提取其水层。然后，用碱水溶液数次洗涤醇层中的提取物，并真空浓缩或使其沉淀，得到固体。

该显示水溶性的固体主要包含由下式I代表的积雪草苷和羟基积雪草苷：(式I略)

用于本发明中的醇溶液包含含醇量为50-80％的甲醇或乙醇。用于本发明中的卤化物溶剂选自二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷和二氯乙烯。就所述含水层的提取而言，使用包含至少4个碳原子的醇例如选自正丁醇、仲丁醇和戊醇。作为碱溶液使用氢氧化钠或氢氧化钾水溶液。

通过上述过程得到的自Centella asiatica的提取物主要由4∶6-6∶4的积雪草苷和羟基积雪草苷组成，已发现所述两种成分占该提取物的97％或以上。它可以溶于水、醇和植物油。尤其，因为所述提取物在水中的溶解性是非常重要的物理性质，所以，在本发明中称其为水溶性TECA(在下文中称作“WS-TECA”)。

2.保护肝细胞试验

使用已知的代表性毒物四氯化碳和半乳糖胺在初期培养的wistars鼠的肝细胞中诱发毒性，检验WS-TECA的毒性阻断作用和恢复作用。

A)试验动物

使wistars鼠(雄性，150-200g)在温度为22±1℃和湿度为60±5％，昼夜每12小时更换的条件下，自由觅食和饮水。自试验前一天起使其禁食。

B)wistars鼠的肝细胞培养