[发明专利]甲状旁腺素相关蛋白人源化抗体及其制备方法

说明书

本发明属于人源化基因工程抗体领域

甲状旁腺素相关蛋白(Parathyroid Hormone-Related Protein，PTHrP)具有与甲状旁腺素蛋白(Parathyroid Hormone PTH)相似的生物活性，它最早发现于恶性肿瘤所致的体液性高钙血症(HumoralHypercalcemia of Malignancy，HHM)患者的血液中，鳞状细胞癌、乳腺癌、泌尿系统癌、卵巢癌等肿瘤组织都能产生PTHrP，是引起HHM的因素之一。HHM在临床上表现为无食欲、恶心、多尿、精神异常甚至昏迷，一般多出现在癌症末期，严重影响其预后，而几乎在所有伴有HHM的肿瘤患者的血液中都能检测到PTHrP，因此对PTHrP的研究引起医学界极大的重视。目前得到医学界广泛认可的降低与肿瘤相关的高钙血症HHM的手段之一就是利用PTHrP的中和抗体对PTHrP进行免疫中和，在降低血钙的同时也抑制了分泌PTHrP的肿瘤细胞的生长，从而起到治疗肿瘤的目的。到目前为止人们已利用多克隆抗血清和鼠源性单克隆抗体对肿瘤细胞分泌的PTHrP进行免疫中和，从而降低了高钙血症，抑制了肿瘤细胞的生长。

目前，有关研究人员已利用杂交瘤技术得到抗PTHrP的单克隆抗体(专利号US5217896)，这种抗体能成功地检测、诊断和治疗由恶性肿瘤引起的高钙血症。建立鼠源性杂交瘤细胞系得到单克隆抗体的方法是抗体发展史上的一大革命，得到的抗体特异性强，已大量应用于临床。但是，单克隆抗体制作周期长，建株不稳定，重复性差。最主要的是杂交瘤所制单克隆抗体是鼠源性抗体，在人体上多次应用后会引起免疫反应，因而限制了其在临床上的普及应用。

自1989年首次报道利用抗体库技术制备人源化单克隆抗体以来，该技术已有了长足的发展(Ninnsim A,Hoogenboon HR,Tomlinson IM et ala.,Antibody fragments from a single pot phage display as immunochemicalreagentsa.EMBO J,1991；13:692)。目前已能从经过免疫或未经免疫的天然抗体库中筛选出多种抗半抗原、蛋白质、病毒粒子等人源化抗体或抗体片段。

在人体内，完整的抗体由四条链组成，即两条轻链L(VL+CL)和两条重链H(VH+CH1+CH2+CH3)。经修饰和改造后的人源化抗体片段可由VL+VH组成，也可由VL+CL和VH+CH1组成。如果抗体片段是单链形式，轻链和重链片段之间可由一个连接肽(Linker)相连，如果抗体片段VL+CL和VH+CH1由羧基端形成二硫键连接，即形成了体内抗体片段Fab。这种人源化抗体或抗体片段除了能达到和杂交瘤所制的单克隆抗体类似的效用，还有鼠源单克隆抗体无法比拟的优越性。

但到目前为止，还没有甲状旁腺素相关蛋白人源化基因工程抗体及其制备方法的报道。

本发明的目的是提供甲状旁腺素相关蛋白人源化基因工程抗体及其制备方法，其技术路线如下：

从肿瘤病人外周血中收集淋巴细胞，提取mRNA，逆转录成cDNA，设计引物，用PCR反应扩增出重链H的VH+CH1基因和轻链L的VL+CL基因。根据已经报导的人抗体基因家族性保守序列设计引物，引物两端设计的酶切位点与噬菌体递呈载体上相应的克隆位点一致。用聚合酶链反应扩增VH+CH1基因和VL+CL基因。

将重链VH+CH1基因和轻链VL+CL基因先后连接到载体上转化大肠杆菌。在辅助噬菌体的帮助下，有结合功能的免疫球蛋白分子片段Fab在丝状噬菌体的表面表达出来，构成抗体片段基因组合文库。噬菌体递呈载体pComb3上有相应的克隆位点，见图1。

重组载体转化大肠杆菌，重链VH+CH1和轻链VL+CL在导肽的带领下在大肠杆菌质周腔内装配成有结合功能的免疫球蛋白分子片段Fab，即二者在羧基端形成二硫键连在一起，和体内抗体装配的模式一样。Fab片段和噬菌体外膜蛋白gⅢ蛋白(由辅助噬菌体提供)融合表达，递呈在噬菌体表面，构成了抗体片段基因的组合文库，在此简称文库。

用PTHrP抗原对文库进行扩增、淘洗和筛选，得到阳性株。将文库进行扩增，加入已包被了抗原PTHrP的反应孔中进行孵育，递呈在噬菌体表面的Fab抗体与抗原牢固结合，其它非特异性噬菌体被冲洗掉，再扩增和抗原结合的噬菌体，如此反复，即可筛选到抗PTHrP的抗体片段Fab，序列分析已筛选到的抗体基因重链VH+CH1和轻链VL+CL，与人抗体基因序列数据库进行比较以确保其正确性。