[发明专利]用于基因诊断的毛细管电泳无胶筛分体系

说明书

本发明涉及毛细管电泳技术，特别提供了一种用于基因诊断的毛细管电泳无胶筛分体系。

理论上说，凝胶是毛细管电泳的理想介质，它粘度大，抗对流，能减少溶质的扩散，因此能限制谱带的展宽，所得的峰型尖锐，柱效极高，已被广泛地用于蛋白质和DNA片段的分离，如文献一(Cecilia Gelfi,Antonia Orsi,Pier GiorgioRighetti,Valeria Brancolini,Laura Cremonesi,Maurizio Ferrari.Electrophoresis.1994,15:640-643)提供了一种用聚丙烯酰胺为凝胶物质的毛细管电泳体系，使用10μm的溴化乙锭(EtBr)为添加剂提高分离，对造成囊性纤维变性的基因微卫星(microsatellite)DNA片段进行了分析，能够分离相差4个碱基对的基因片段，该体系生物相容性差，且具有较强的毒性，另外其中使用的溴化乙锭添加剂具有很强的基因透变性，对人体和环境均有很大危害。此外，其还有凝胶电泳常见的通病，造成柱内空泡且毛细管寿命较短。用粘度较小的线性聚合物比如甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素代替聚丙烯酰胺可形成无凝胶，但有筛分作用的纤维素无胶筛分体系，与凝胶柱相比，其避免了空泡的产生，且便宜，操作简单，寿命较长，如文献二(Yoshinobu Baba,Riyo Tomisaki,Chinuyo Sumita,Izumi Morimoto,Sanae Sugita,Mitsutomo Tsuhako,Tetsuro Miki,ToshioOgihara.Electrophoresis.1995,16,1437-1440)提供了一种应用单一的甲基纤维素为筛分剂，使用1μm/ml溴化乙锭(EtBr)为添加剂提高分离的无胶筛分体系，分析了能够导致心脏病的apoB基因的varible number tandem repeat(VNTR)等位基因片段。由于使用单一的甲基纤维素为筛分介质，其分辨率较差，并且同样不能避免溴化乙锭添加剂对人体和环境的损害。文献三(Jing Cheng and Keith R.Mitchelson.Anal.Chem.1994,66:4210-4214)提供了一种使用单一羟丙基甲基纤维素作为筛分剂的无胶筛分体系，为了解决单一羟丙基甲基纤维素分离能力差的问题，使用甘油作添加剂以提高分离，由于甘油分子结构方面的原因，其分离效率的提高效果并不十分显著。

本发明的目的在于提供一种可用于基因诊断的毛细管无胶筛分体系，应用安全方便，且大大提高分离效率。

本发明提供了一种用于基因诊断的毛细管电泳无胶筛分体系，其特征在于：该体系以TBE为背景电解质，以混合的羟丙基甲基纤维素为筛分介质，以尿素为变性剂，以甘露醇为添加剂；

TBE的浓度范围是80～250mMTris,80～250mMBorate,2mMEDTA；

尿素的浓度范围是3.5M～7M；

甘露醇的浓度范围是4％～8％；

混合的羟丙基甲基纤维素为1.2％～2.4％。

在没有变性剂存在的情况下，DNA在毛细管中的迁移不仅与长度有关，而且与DNA分子的空间构型有关，而后者严重地影响对DNA分子大小的确定，给PCR(聚合酶链式反应)产物的分析定性带来了不良的影响。尿素作为变性剂可以使DNA分子空间构型对分离的影响得以消除，DNA分子在毛细管中的迁移只与其分子大小有关，可以用标准曲线法根据迁移时间来确定DNA片段的大小，有利于毛细管电泳对PCR产物的分析。但是尿素变性剂的存在使纤维素衍生物体系对DNA分子的分离能力明显降低。在体系中加入甘露醇作为添加剂，由于甘露醇分子、纤维素分子以及硼酸根之间的络合相互作用，扭转了尿素对筛分能力造成的负面影响，大大提高了此无胶筛分体系的筛分能力，使之能够适用于对医学上感性趣的卫星DNA片段的分析，对某些遗传性疾病的基因诊断具有重大的意义。总之本发明采用混合的羟丙基甲基纤维素为筛分介质，使用尿素为变性剂消除DNA分子结构对分离的影响，使用甘露醇为添加剂提高分离效率。羟丙基甲基纤维素的生物相容性好，尿素、甘露醇对人体和环境也没有毒性，使用安全方便。

下面结合附图通过实施例详述本发明。

附图1为PBR322/HaeⅢDNA标准片段的毛细管无胶筛分电泳图。

附图2为苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因的短串联重复(STR)片段的毛细管无胶筛分电泳图。

附图3为苯丙酮尿症家系中父亲和母亲的苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因的短串联重复(STR)片段的毛细管无胶筛分电泳图。