[发明专利]新型玻璃化固相酶免疫测定方法

说明书

本发明属于生物技术领域。

用固相酶免疫原理，制备检测感染性疾病、肿瘤标志物、内分泌激素等的商品化试剂盒，在目前国内外有大量的市场需求，对有些检测项目如乙肝表面抗原、丙型肝炎抗体，艾滋病抗体及早孕的免疫检测试剂盒，其质量在特异性、灵敏度等方面已接近或达到了国际先进水平，但是其均为瓶装液体试剂，有效期短，多为6个月的有效期，且要求严格的2-8℃保存和运输条件，这样的产品在远距离运输中对温度要求常常得不到保证，从而影响产品的质量。面对国际市场，本来在特异性，灵敏度指标上达到或接近国际先进水平的试剂，因其稳定性差、效期短、批内批间差异大而总体质量落后于国际水平，根本无法出口外销。另外，用户在使用过程中要用滴瓶或加样器加酶标记物，增加了一定的工作量和增大了加样误差。

本发明的目的是提供一种新型玻璃化固相酶免疫测定方法，由其制成的免疫试剂盒免去液相酶标，便于运输、保存，且有效期长。

本发明通过以下技术方案完成：

我们将原属化学工业应用的“玻璃化”原理引入生物技术领域，并解决了蛋白类物质也可“玻璃化”的技术问题。将包被和标记的抗原或抗体等生物活性物质用复合配方，寻找适宜的“玻璃温度点”，使包被和标记物同时固相化于常用的聚苯乙烯反应板孔中，同时在标记物的玻璃化过程中为防止其非特异性的产生而采用了微粒成型技术，本发明技术工艺流程如图1所示：

1.抗原或抗体的包被；

2.包被抗原或抗体的玻璃化；

3.酶标记物玻璃化配方选择及配制；

4.酶标记物微粒子配方的选择及微粒子化；

5.酶标记物的玻璃化。

不同的抗原或抗体，因其分子量、等电点、分子形状、氨基酸序列及其空间结构的不同，其最佳包被条件亦不同。不同的单质物质具有特定的玻璃温度点，而蛋白质类的物质其玻璃温度点均在变性温度之上，也就是说玻璃化的蛋白质无生物活性，所以经反复测试确定了适合于抗原或抗体类蛋白质玻璃化的复合配方，使包被于聚苯乙烯载体上的生物活性抗原或抗体玻璃化于载体表面，同时将酶标记物配制在双极性的溶液中进行微粒子化，将微粒子化的酶标记物溶于玻璃化复合配方中进行玻璃化，这样就在聚苯乙烯板孔中将包被物和酶标记物“共存于一起”了，而现行的所有固相酶免疫测定方法中包被物和酶标记物均是“分离”的。

现讲述本发明在乙型肝炎“两对半”检测试剂盒中的应用实施例：

乙型肝炎是严重危害我国人民健康的病毒性疾病，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性携带率在我国约有一亿二千万人。乙型肝炎“两对半”是乙型肝炎病毒感染人体后的最主要标记物，检测这些标记物可以用以诊断、指导治疗，预后观察及流行病原调查。目前乙型肝炎“两对半”检测试剂盒95％以上为应用固相酶免疫原理生产的瓶装液体试剂，效期多为6个月，储存和运输要求温度为2-8℃，我们应用玻璃化固相酶免疫技术研制和连续中试生产三批乙型肝炎“两对半”检测试剂盒，其质量均达到设计要求，乙型肝炎“两对半”具体指表面抗原(HBsAg)、表面抗体(Anti-HBs)、E抗原(HBeAg)、E抗体(Anti-HBe)和核心抗体(Anti-HBe)。

(一)HBsAg、HBeAg和Anti-Hbe