[发明专利]人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体

说明书

本发明涉及治疗用人源基因工程单克隆抗体的制备及应用，尤其是特异性针对汉坦病毒糖蛋白的中和性基因工程单克隆抗体。运用噬菌体表面表达(PhageDisplay)技术，从流行出血热疫区恢复期病人抗凝血中分离到的外周淋巴细胞中提取了总细胞RNA，通过RT-PCR方法，用一组人IgGFab基因特异性引物，从合成的cDNA中PCR扩增了一组轻链和重链Fab段基因，将轻链和重链先后插入噬菌体载体pComb3，成功地建立了抗汉坦病毒抗体基因库，并用纯化的汉坦病毒颗粒以及抗汉坦病毒糖蛋白鼠单抗捕捉糖蛋白抗原的方法对此抗体库进行了富积筛选表达，获得人源中和性抗汉坦病毒汉坦型基因工程单克隆抗体Fab段基因及其表达。核苷酸序列分析证实所获基因为人源IgGFab基因，用特异性放射免疫沉淀(IP),IFAT和ELISA以及空斑减少中和试验鉴定表明，表达的人Fab抗体识别汉坦病毒糖蛋白G1，具有体外中和活性。作为一种潜在的治疗用抗体药物，这种中和抗体有望在将来被用于汉坦病毒引起的肾综合征出血热。

自1975年B淋巴细胞杂交瘤细胞融合技术问世以来，单克隆抗体作为临床诊断，临床治疗和预防的新型产物，其运用价值和开发前景已获得普遍的肯定分子生物学和分子免疫学的研究发展导致了基因工程单克隆抗体的产生和发展。通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源，兔源及人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景国内外对基因工程单克隆抗体，尤其是人源化或人源抗体的研究已有10余年。而80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术侧已成为当今世界人源基因工程单克隆抗体研究的热点。目前已发展成功的基因工程单克隆抗体的形式有：1)人-鼠嵌合抗体，即将鼠单抗轻，重链可变区基因VL和VH分别与人抗体轻，重链恒定区基因CL和CH连接形成人-鼠嵌合轻链和重链基因，并在骨髓瘤细胞，昆虫细胞及CHO细胞中获得表达。2，重构抗体或人源化抗体，即用特异性鼠单抗Fab段中的高变区CDR区替代人单抗Fab段中的CDR区或在人-鼠单抗中将鼠Fab段中FR区中的表面决定族碱基替换成人抗体相应的基因序列。我国也已有成功报道。3)小分子抗体，包括Fab(完整轻链和Fd),sFv(VH和VL经一小连接肽相连)，Fv(VH和VL组成)VH及MRU(最小识别单位)通过杂交瘤细胞或建立的噬菌体抗体基因库，获得Fab或sFv在原核细胞中表达。4，重组全抗体，即整个免疫球蛋白分子包括IgG,IgA分别在淋巴瘤细胞，非淋巴瘤细胞如CHO细胞以及杆状病毒系统中的表达。

噬菌体表面表达多肽或蛋白技术创始于1985年。用此技术构建噬菌体抗体基因库是最近5-6年发展的热点。从抗体库筛选的抗体表达形式主要以Fab段抗体和scFv为主。用以构建抗体基因库的噬菌体载体系统目前已构建和发展很多，其中比较有代表性的表达系统是由美国Scripps研究所研究而成的pComb系统，其基本原理是将PCR扩增的全套抗体轻链基因组和全套重链基因组插入噬菌体载体pComb3中，其中Fd以与蛋白Ⅲ或蛋白Ⅷ融合蛋白的形式，轻链则以独立表达的形式，通过先导序列pelB分泌入细菌细胞间隙并组装成Fab，经辅助噬菌体感染后组成噬菌体抗体库。通过使用特异性抗原对抗体库进行富积筛选获得特异性抗体基因。1990年Scripps研究所从破伤风毒素免疫的供者外周血B细胞中首次获得人抗体基因库并获得人抗破伤风毒素单克隆抗体。至今此技术已较广泛用构建鼠和人抗体基因库并取得重要进展，通过噬菌体载体表达系统由其是pCom3表达系统建立抗体库从而获得抗病毒人单克隆抗体在国外已有成功的报道。目前世界上已报道的从噬菌体人抗体基因库中筛选到的抗病毒人单抗有：抗流感病毒单抗，抗HBsAg抗体，抗呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白抗体，抗单纯疱疹病毒抗体，抗HIVgp120抗体以及抗汉坦病毒核蛋白抗体等。上述抗体均以Fab段形式在大肠杆菌中表达，并同时获得特异性抗体基因序列。