[发明专利]从大赖草中提取与穗形相关成分的高活性DNA的方法

说明书

本发明涉及一种从大赖草中提取与穗形相关成分的高活性DNA的方法，尤其是从大赖草中提取总DNA，通过花粉管通道将其转化到小麦中去。

大赖草(Leymus raceaus)[lam]Jzvel是一种生长在半干旱荒漠边缘的多年生杂草，为禾本科赖草属(Leymus Bochst)植物，它具有抗干旱，耐碱，高度抗病、抗虫、穗大、粒多、籽粒蛋白质含量高等多种优良遗传性状，因而在分子育种工作中是个比较理想的优良基因供体。本发明经过多年田间试验证明，大赖草基因中含有高活性的与穗形相关的成分，将该成分通过花粉管通道转化外源基因至培育小麦中去，它能较早的影响小麦的穗形，并最终产生出大穗形小麦。

本发明目的在于，研究确定大赖草核酸中高活性与穗形相关的成分，首先将大赖草叶片经液氮研磨、抽提、低速离心进行两相分离，沉淀出总DNA，再经乙醇洗涤抽干，灭菌，经RNase保温处理后过Sepberose-2B柱分离总DNA和RNA，收集总DNA再进行纯化处理，将纯化后的总DNA经超声波破碎成DNA片段，通过花粉管通道将其转化到小麦中去即可。该方法经过反复试验证明，采用该方法确定大赖草核酸中高活性与穗形相关的成分，是行之有效的，其小麦的穗形均都产生了大穗形变异转化株，经过分子杂交检测，证实大穗小麦是由于大赖草基因转化后产生的结果。

本发明所述的从大赖草中提取与穗形相关成分的高活性DNA的方法，首先将大赖草叶片经液氮研磨，用三羟基氨基甲烷盐酸(Jris-HCl)缓冲液及十二烷基磺酸钠抽提，60℃热酚—氯仿处理，低速离心进行两相分离，水相经异丙醇沉淀，提出总DNA，再经70％乙醇洗涤后抽干，溶于灭菌水中，经RNase保温处理后，过Sepberose-2B柱分离总DNA和RNA，收集总DNA，将收集的总DNA峰，经乙醇沉淀后抽干，溶于JE缓冲液中，得纯化后的总DNA，然后再经超声波及限制性内切酶酶切成大小为0.5-10kb的DNA片段，通过花粉管通道将其转化到载培小麦中去即可。

实施例

取1克大赖草叶片，经液氮研磨，加入10ml三羟基氨基甲烷盐酸缓冲液及1/10体积10％的十二烷基磺酸钠抽提，等体积各50％热酚—氯仿处理，于60℃保温10分钟，低速离心进行两相分离，水相加入0.6倍体积的异丙醇沉淀，提出总DNA，再用70％乙醇洗涤后抽干，溶于灭菌水中，加入RNasp50mg/ml，37℃、0.5小时保温，过Sepherose-2B柱，收集第一峰，再经乙醇沉淀后抽干，溶于TE缓冲液中，得纯化后的总DNA，再经超声波及限制性内切酶酶切成大小为0.5-10Kb的DNA片段，再通过花粉管通道将其转化到栽培小麦中去即可，可获得大穗形变异转化株。