[发明专利]用于病原体及相关抗生素抗性基因检测以进行诊断的种、属特异性和通用的探针及引物

权利要求书

1.使用特异性、普遍适用并灵敏的探针和/或扩增引物从怀疑含有下述细菌和/或真菌核酸的任何样品中确定下列来源的核酸的存在和/或量的方法：

-选自下列组中的抗生素抗性基因：bla_tem、bla_shv、bla_rob、bla_oxa、blaZ、aadB、aacC1、aacC2、aacC3、aac6′-IIa、aacA4、aad(6′)、vanA、vanB、vanC、msrA、satA、aac(6′)-aph(2″)、vat、vga、ermA、ermB、ermC、mecA、int和sul，以及

-选自下列组中的特定细菌和真菌菌种：屎肠球菌、单核细胞增生利斯特氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、无乳链球菌、白假丝酵母、肠球菌属、奈瑟氏球菌属、葡萄球菌属、链球菌属和假丝酵母属，

其中所述每一种核酸或其变体或其部分包含可与所述探针或引物杂交的选定靶区域；

所述方法包括下列步骤：在杂交或扩增的相同条件下使所述样品与所述探针或引物接触，并检测已杂交的探针或扩增产物的存在和/或量，以作为所述特定细菌和/或真菌菌种或属，同时还有所述细菌抗生素抗性基因的存在和/或量的指征。

2.根据权利要求1的方法，其中还使用特异的、普遍适用并灵敏的探针和/或引物以同时确定任何细菌或真菌的核酸的存在和/或量。

3.根据权利要求1的方法，其为直接对试验样品进行。

4.权利要求1的方法，其是直接对由细菌和/或真菌培养物或悬液组成的试验样品进行的。

5.权利要求1的方法，其中所述核酸均是在相同的杂交或扩增条件下进行检测的。

6.权利要求1的方法，其中所述核酸是用选自下列组中的方法扩增的：

a)聚合酶链反应(PCR)，

b)连接酶链反应(LCR)，

c)基于核酸序列的扩增(NASBA)

d)自身维持的序列复制(3SR)，

e)链置换扩增(SDA)，

f)分支DNA信号扩增(bDNA)，

g)转录介导的扩增(TMA)，

h)循环探针技术(CPT)，

i)嵌套PCR，和

j)多重PCR。

7.权利要求6的方法，其中所述核酸是用PCR法扩增的。

8.权利要求7的方法，其中PCR方法在同样扩增条件下，以每扩增循环为45-55℃30秒钟的退火步骤和95℃1秒钟的变性步骤，而没有特别用于延伸步骤的任何时间的程序进行，在1小时内完成对所述核酸存在情况的检测。

9.直接从试验样品或从细菌和/或真菌培养物检测、鉴定和/或定量测定选自下列一组中的微生物的方法：屎肠球菌、单核细胞增生利斯特氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、白假丝酵母、肠球菌属种、奈瑟氏球菌属种、葡萄球菌属种、链球菌种和假丝酵母属种，该方法包括以下步骤：

a)使所述样品或从该样品中分离的所述微生物的基本均质的群体的微生物DNA沉积并固定在惰性载体上或留在溶液中，或者

将所述样品或所述从该样品分离的基本均质的微生物群体接种在惰性载体上，并在原位裂解该接种样品或分离微生物，以释放微生物DNA，

所述微生物DNA基本上制成单链形式；

b)在所述探针的核酸能够选择性地与所述微生物DNA杂交的条件下，使所述单链DNA与探针接触，从而形成杂交复合物，其中所述探针至少包括一种单链核酸，该单链核酸的核苷酸序列选自SEQ IDNO：26、27、28、29、30、120、131至134、31、140至143、32至36、120至124，其互补序列、其至少有12个核苷酸长的部分及其变体，并可特异地和普遍适用地相应与屎肠球菌、单核细胞增生利斯特氏菌、腐生葡萄球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、无乳链球菌、白假丝酵母、肠球菌属种、奈瑟氏球菌属种、葡萄球菌属种、链球菌属种和假丝酵母属种的菌株或典型代表一起退火；以及

c)检测所述惰性载体上或所述溶液中所述杂交复合物的存在作为所述试验样品中所述微生物的存在和/或量之指征。