[发明专利]体内重组

权利要求书

1.用于体内重组同源DNA序列的方法，包括以下步骤

a)在利于一种DNA结构整合入另一种DNA结构中的条件下培养含有至少两种DNA结构的细胞，其中的每种DNA结构包括DNA序列和复制起点，继而形成杂交DNA结构；

b)在利于从所述杂交DNA结构中切除的条件下培养该细胞，继而形成新的DNA结构，其中的每种DNA结构包括重组的DNA序列与复制起点；

c)重复步骤a)-b)至少一次。

2.用于体内重组同源DNA序列的方法，包括以下步骤：

a)在其中的i)至少一个复制起点没有功能和ii)该细胞在仅允许含有无

  功能起点DNA结构细胞生长的选择压力下(即，利于一种的DNA

  结构的整合入另一种结构中，继而形成杂交DNA结构)的条件下培

  养含有至少两种DNA结构的细胞，其中的每种DNA结构包括DNA

  序列与复制起点；b)将所述的条件变为另一种条件，该条件与步骤a)的相比，无功能的复制起点较少(即，利于从所述的杂交DNA结构中切除；c)重复步骤a)-b)至少一次。

3.根据权利要求1-2的方法，其特征在于至少一种DNA结构为染色体，优选为细菌染色体，更为优选为芽胞杆菌染色体，特别优选为枯草芽孢杆菌染色体。

4.根据权利要求1-3的方法，其特征在于至少一种DNA结构为载体，优选为细菌载体，更为优选为能够在芽孢杆菌细胞中复制的载体，特别优选为能够在枯草芽孢杆菌细胞中复制的载体。

5.根据权利要求4的方法，其中的至少两种DNA构建体为两种不同的载体。

6.用于体内重组同源DNA序列的方法，包括以下步骤a)将同源DNA序列插入到至少两种不同的载体中，所述的载体含有不同的  复制起点；b)将这些载体转入细胞中；c)在其中的i)至少一个复制起点为无功能和ii)该细胞在仅允许含有无功能起  点的DNA结构的细胞生长的选择压力下(即，利于一种DNA结构整合入  另一种结构中，继而形成杂交DNA结构)的条件下培养该细胞；d)将所述的条件变为其它的条件，该条件与步骤c)的相比，无功能的复制起  点较少(即，利于从所述杂交DNA结构中切除)；e)按需要重复步骤c)-d)许多次，但至少一次。

7.根据权利要求1-6的方法，其特征在于以载体的复制速度可由化学或物理调节的方式筛选出至少一种复制起点。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于至少一种复制起点为温度敏感性的。

9.根据权利要求8的方法，其特征在于至少一种载体的复制速度可由温度变化来调节。

10.根据权利要求1-9的方法，其特征在于这些载体含有标记基因，优选为可选择的标记基因，特别是抗生素标记基因。

11.根据权利要求10的方法，其特征在于这些载体含有不同的标记基因。

12.根据前面任一权利要求的方法，其中至少一种DNA结构不包括ori(-)(即仅包括ori(+))。

13.根据权利要求12的方法，其中的不包括ori(-)的DNA结构为其起点(即，这里的Ori(+))在根据前面任一权利要求方法而进行的杂交DNA结构形成中具有功能的DNA结构。

14.根据前面任一权利要求的方法，其中优选通过具有一种DNA结构的系统在体内测定杂交结构的形成，其中的体内可筛选蛋白仅在该杂交结构形成后表达。

15.根据权利要求14的方法，其中所述的可筛选蛋白为在适宜的曝光条件下发荧光的蛋白，且特别地，所述的荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)或其变异体。

16.根据前面任一权利要求的方法，其中的从杂交DNA结构中切除为强制的切除事件。