[发明专利]淀粉含量提高的转基因植物

说明书

本发明涉及经过修饰的、产淀粉能力增强的植物，以及能够再生成这种植物的植物细胞。本发明还涉及用于质量增强淀粉的生产方法和用于植物转化的重组DNA分子。

淀粉是在高等植物中所发现的主要的贮存碳水化合物，并且因此是全球人类饮食中最大的单一能量来源。除其本身作为重要的粮食之外，淀粉的物理特性(形成凝胶和胶体)导致它主要作为加工食品的天然添加剂(增稠剂)。淀粉还有重要的非食品用途，在造纸和纺织工业中可作为胶粘剂的组分。在后一种情况下，淀粉的物理特性尤为重要。运用淀粉的其它工业有塑料工业和制药工业；在制药工业中淀粉例如可用作惰性载体。淀粉的物理特性部分取决于直链淀粉(长而直的聚糖链)与更高度分支的支链淀粉之比。在最近几年中，人们对用生物工程产业改变淀粉的质量和数量产生了很大兴趣。尤其是主要目的在于产生经过遗传修饰的、淀粉含量增加或所含淀粉的结构不同于自然界淀粉的植物。由于马铃薯易于应用转基因技术，所以到目前为止，大多数工作集中于马铃薯植物种上。

对淀粉质量的操作已取得了一些成功。例如，虽然对内源性淀粉生物合成酶的操作只微微影响产量，但所产淀粉的物理特性却常常大幅度改变(Müller-Rber等，1994)；这些变化从机械学方面尚无较好的理解。最近一种细菌淀粉分支酶在马铃薯的无直链淀粉变种中的表达，导致产生非常高度分支的支链淀粉(Kortstee等，1996)。目前产生的许多淀粉结构变异具有潜在的商业用途。

提高淀粉产量的方法只取得有限的成功。无论从马铃薯本身或其它物种，一些编码淀粉生物合成酶的基因的过量表达，尚未使块茎的淀粉含量提高(Müller-Rber等，1994)。通过编码非调节形式的ADP-葡萄糖焦磷酸酶的突变细菌基因的表达，使块茎的淀粉含量适度提高大约20％(Stark等，1992)，这是获取的有限进展。但是最近在较高产马铃薯变种中重复该方法的工作，无论在大田或温室条件下，并未表现出淀粉含量提高(Herbers等，1996)。总之，仍有相当大的余地来提高转基因马铃薯植物的块茎淀粉含量。

NAD-苹果酸酶(NAD-ME)是普遍存在于高等植物中的代谢酶，但对其功能目前有争议。它催化苹果酸的氧化脱羧：

总体来说，该酶是NAD-联动(linked)的苹果酸脱氢酶(脱羧)(非OAA脱羧)，酶分类为EC 1.1.1.39。在此称为NAD-ME。

作为对三羧酸(TCA)循环(参见图1)通量控制的一般性研究的一部分，分离了编码NAD-ME亚基的cDNA克隆。在马铃薯中，存在分别为62kDa和59kDa的两种NAD-ME亚基(Winning等，1994)。为了更好地了解NAD-ME的功能，产生了以反义方向表达编码59kDa亚基的cDNA克隆的转基因马铃薯植物，总目的在于降低植物中的NAD-ME活性，并确定代谢结果(Hill等，1996)。先前的研究表明，这些转基因植物中的NAD-ME活性已降低至野生型植物中NAD-ME活性的40％，但未显示明显的形态学表型或生长速率的改变。

现已发现，降低马铃薯植物中的NAD-ME活性，该植物块茎的淀粉含量显著提高。NAD-ME定位于线粒体中，因此在代谢方面不同于在马铃薯块茎的造粉体中进行的淀粉合成途径(参见图1)。观察到的淀粉合成效应通过一个或多个代谢物浓度而介导。这就为提高淀粉含量提供了新方法。如前所述，先前操纵淀粉合成的的努力集中在淀粉生物合成酶本身。一旦一种其浓度通过NAD-ME活性的降低而改变的代谢物得以鉴定，则有可能设计另一种策略来操纵该代谢物浓度、继而控制淀粉含量。事实上，已经表明3-磷酸甘油酸(3-PGA)含量的增加与淀粉含量的增加相关。预期这种情况也适用于其它代谢物。本领域技术人员能够鉴定更多代谢物并操纵其浓度。

因此本发明一方面提供产生淀粉的方法，有以下步骤：

a)提供一种植物，该植物经过修饰，以便因改变了为糖酵解和三羧酸循环的中间物的一个或多个代谢物的浓度，而使植物中的淀粉含量提高；并且：

b)从该植物收集含淀粉的材料。

另一方面，本发明提供经过修饰的植物，作为在糖酵解和三羧酸循环的中间物的一个或多个代谢物的浓度改变后的结果，该植物中的产淀粉能力增强，条件是排除通过反义技术降低NAD-ME活性的马铃薯植物；本发明还提供经过遗传修饰、以便能够再生成经过修饰的植物的植物细胞。

另一方面，本发明提供上述修饰植物的用途，即用于产生含淀粉材料；以及上述修饰细胞的用途，即再生成产生含淀粉材料的植物。