[发明专利]基于染料二聚作用的生荧光蛋白水解酶底物

说明书

发明领域

本发明涉及制备和使用蛋白水解酶底物的方法，这种底物会经酶水解而发出强烈的荧光。本发明可用于微生物检测和鉴定、灭菌检测、药物开发、酶试验、免疫试验及其它生物测试。

发明背景

蛋白水解酶是一类催化水解肽键的酶。它们的一级结构和独特的三维结构决定了它们的活性和专一性。根据活性位点的组成，蛋白水解酶主要分成天冬氨酸蛋白水解酶、金属蛋白水解酶、巯基蛋白水解酶和丝氨酸蛋白水解酶。蛋白水解酶的生理作用是众所周知的。它们不仅参与消化、血凝和血纤蛋白溶解等功能(Lottenberg，R.；Christensen，U；Jackson，C.M.；Coleman，P.L.，利用肽生色和生荧光底物进行的凝聚蛋白水解酶测试(Assay of Coagulation Proteases Using PeptiedeChromogenic and Fluorogenic Substrates)；Methods in Enzymology 1981：80：341-361)，而且还参与排卵、致瘤、免疫应答和病毒及细菌感染等(Livingston，D.C.；Brocklehurst，J.R.；Cannon，J.F.；Leytus，S.P.；Wehrly，J.A.；Peltz，S.W.；Peltz，G.A.；Mangel，W.F.，新的丝氨酸蛋白水解酶荧光活性位点滴定剂的合成和特征说明(Synthesis and characterization of a new fluorogenic active-site titrant of serineprotease)；Biochem.1981，20：4298-4306)。例如，已知例如HIV的逆转录病毒编码一种蛋白水解酶，它在特定的剪切位置加工前体蛋白。这种剪切发生在病毒包装时，而且是感染性病毒颗粒成熟所必需的。所以，抑制这种蛋白水解酶已经成为设计抗包括AIDS在内的抗病毒药物的重要目标。

此外，人们对于具有抗生素抗性的菌株和由食物引起的疾病有了越来越多的认识。在物保健、化妆品、食品和饮料行业控制微生造成的危害是一个重要的健康和安全问题。细菌检测是控制微生物危害不可缺的一部分。许多细菌能够产生蛋白水解酶，这被广泛用作鉴定和表征某些致病菌的标准。

要阐明和理解蛋白水解酶的生物功能、诊断生理疾病和开发新药，必需进行灵敏而且定量的酶测试。已经用了许多技术来测量蛋白水解酶的活性，其中包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、高性能液相层析(HPLC)、蛋白免疫印迹分析和薄层电泳分析。但是，这些方法往往需要许多步骤和试剂，而且操作起来很慢很昂贵。有时它们并不适合某些应用，例如大量筛选药物例如蛋白水解酶抑制剂。

生荧光物质即经酶水解从非荧光性变成强荧光的分子。它们被广泛用作分子探针研究和测试病毒和细菌的蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、磷酸酯酶和激酶(Manafit，M.；W.；Bascomb，S.，用于细菌诊断的生荧光和生色底物(Fluorogenic andChromogenic Substrates used in Bacterial Diagnostics)；Microbiological Reviesws1991，55：535-348)。在UV照射下，利用荧光显微镜，可以在96格测试板读数仪中或在流式细胞计数仪中方便地观察荧光。

有几种市售的生荧光蛋白水解酶底物。例如EnzCheck^TM试剂盒(MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR)，使用的是带有荧光团4，4-二氟-4-硼酸-3a-氮鎓-4a-氮杂-s-indacene(BODIPY)的快速猝灭酪蛋白底物。切断时，荧光性BODIPY-肽被释放。通常，如果胰蛋白酶浓度高达500ng/ml，在530nm可以观察到强度增加2倍的荧光。有一种HIV蛋白水解酶的生荧光底物(Molecular Probes，Inc.)，它具有HIV蛋白水解酶的剪切位点，其一侧有荧光团5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸(EDANS)，另一侧有受体生色团4-(5-二甲基氨基苯基)偶氮苯磺酸(DABCYL)。如欧洲专利申请428,000中所述，EDANS荧光因分子内共振能的转移而被DABCYL生色团猝灭，该过程要求供体和受体在肽链上彼此间的距离不超过100埃。荧光团在340nm被激发，在490nm生荧光，它会因为细菌培养基吸光或荧光而变暗。