[发明专利]获得含有外源DNA的转基因豆科植物(豆科)的方法

说明书

发明领域

本发明涉及利用生物弹道将外源基因引入植物组织和通过转化的组织再生获得转基因的豆科植物

发明背景

利用遗传工程技术引入负责目的农学特性的基因可能有利于开发豆科植物新变种。转基因植物的获得需要将外源DNA引入植物组织并且从这种遗传转化组织再生整株植物。对于要转化的物种，各种类型的组织均可用来引入外源DNA，分生组织优选应用在各种转化方法中，首先是由于从这种类型的组织植物易于再生。各种工艺用来将外源基因引入豆科植物顶端分生细胞，其中指出下面几点：a)农杆菌系统；b)组织电穿孔系统和c)生物弹道系统。外源DNA引入和整合到豆科植物细胞中已由许多科学家证明和在不同的出版物上描述。例如(Aragao F.J.L.，Grossi-de-Sa M.F.，Almeida E.R.，RechE.L.(1992)；在豆子(菜豆)富含甲硫氨酸白蛋白的巴西坚果中粒子轰击介导的表达；植物分子生物学20：357-259，Lewis，M.F.& Bliss F.A.(1994)；接种有根癌农杆菌的菜豆中肿瘤形成和β-葡糖醛酸酶的表达。美国园艺科学协会杂志；119：361-366，Dillen W.Engler G，Van Montagu M.&Angenon G.(1995)；电穿孔法介导的DNA导入豆菜(普通豆)的种子组织，植物细胞通报，15：119-124)。

然而，遗传转化组织的低获取率，从所说转化组织中可育植物低的再生能力，以及所用的转化方法的效力依赖于基因型，均导致很难获得转基因的豆科植物(Brasileiro A.C.M.；Aragao F.J.L.；Rossi S.DussiD.M.A.；Barros L.M.G.；& Rech E.L.(1996)普通和宽叶菜豆对农杆菌株的敏感性和用微粒轰击改进农杆菌介导的转化。美国园艺科学学会杂志12：810-815和Dillen W.；Van Montagu M.& Angenon G.(1995)电子穿孔法介导的DNA传递进豆科(普通豆)籽苗组织中。植物细胞通报15：119-124)。

在80年代末由于生物弹道方法的开发直接将基因引入植物细胞(Sanford J.C.Klein T.M.，Wolf E.D.& Allen N.(1987)，用粒子轰击方法将物质引入细胞组织；粒子科学和技术杂志，5：27-37)已获得了大量的多种转基因植物，包括那些已证明用其他方法不能转化的物种。这就导致在任何类型植物组织中导入和表达外源基因成为可能。因此，任何类型的组织具有用合适的转化再生成一个完整的可育植物的潜能。

生物弹道(biobaListic)方法由Sanford的关于将遗传物质引入高等植物核基因组的综述所建议。从此，它应用的广泛性被推崇，并且在向细菌，后在动物，菌类、藻类、昆虫、植物和动物组织以及在分离的诸如叶绿体和线粒体的细胞器中引入和表达基因被证明是一个有效和简单的方法，这是根据由Sanford J.C，Smith F.D.和Russel J.A.(1993)的观察结果证明的，用于不同生物学应用的优化生物弹道方法，酶学方法217；413-510。更具体的文献，这儿有几个其他应用生物弹道获得转基因生物的例子，例如：英国专利5,565,346，US 5,489,520和WO96/04392，等其它文献。

以高速加速的生物弹道微粒用来在体内运输和引入核酸和其它物质到细胞和组织中(Rech E.L.& Aragao F.J.L.(1997)。生物弹道方法，在Brasileiro A.C.M.& Carneiro V.T.C.(Ed)-植物遗传转化手册：EMBRAPA/Cenargen。这种方法也称为微粒轰击法，“基因枪”法，微粒加速法等等。已开发和构建了能加速微粒(由钨或金制成)的各种系统，其中微粒包有核酸序列，速度超过每小时1500千米。所有系统都基于高能的振动波的形成以替代含有包含DNA的微粒的运载膜。振动波可以通过化学爆破(干粉枪)，在高压下氦气放电产生。以及在高电压和低电容或低电压和高电容下通过电子放电汽化水滴来形成。