[发明专利]4,7－二烷氧基N－乙酰基神经氨酸衍生物及其在临床样本中检测流行性感冒A型和B型病毒的方法

说明书

本发明提供了显色和荧光的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸底物，它可在临床样本中用来检测流行性感冒A型和B型病毒。更具体的是，本发明提供了可用来区分具有神经氨酸酶反应活性的各种病毒的4，7-二烷氧基N-乙酰基神经氨酸底物。这样，流行性感冒A型和B型病毒可用本发明的4，7-二烷氧基-N-乙酰基神经氨酸衍生物来区分于副流行性感冒病毒1、2、3和4型和流行性腮腺炎病毒。

发明背景

感染疾病是人们最通常看内科医生的原因。病毒比所有其它组合微生物更多地导致这些感染。在所有由于病毒产生的各种感染中，呼吸道病毒(流行性感冒A和B；副流行性感冒1、2、3和4；呼吸道合胞(syncytial)病毒和腺病毒)最为流行。人们早已于公元前430年雅典的瘟疫发现了流行性感冒病毒的致死性(Langmuir等，New Engl.J.Medicine，313(1985)1027)。流行性感冒是导致急性呼吸道疾病的首位原因和美国第六位的年死亡因素(每月死亡统计报告(MonthlyVital Statistics Report)，43卷，第6号(1995))。结果，开发出病毒和病毒感染的诊断方法越来越变得重要。

快速诊断病毒感染也已成为行医优良的一个整体部分。一些病毒对于其产生的抗体具有可定义的抗原。因此，免疫分析被广泛地用于测量病毒粒子是否存在。若需要测量病毒粒子较宽的分类，可以检测病毒特定的组份。例如，流行性感冒病毒表达了有神经氨酸酶(唾液酸酶)活性的表面糖蛋白。含2-酮苷连接的N-乙酰基神经氨酸的神经氨酸酶酶水解底物(Neu5Ac，也称为唾液酸)。Neu5Ac由9个碳原子、一个羧基和一个N-乙酰基的骨架构成。下面显示了其一般结构以及用来指出碳原子的编号系统。当具有神经氨酸酶活性的病毒粒子与显色或/灵荧光Neu5Ac糖苷培养时，酶会使显色或荧光的糖苷配基从底物上裂解下来，该反应产物指示有病毒粒子的存在。在本说明书中，与上式中的5-位碳连接的N-乙酰基被称为AcHN。

美国专利5,252,458揭示了通过使酶与酶的显色底物反应检测病毒存在的一个方法，在此并入供参考。Yolken等(传染病杂志(J.Infectious Diseases)，142(1980)516-523)开发了直接测量流行性感冒神经氨酸酶的分析方法。Yolken等使用Neu5Ac的4-甲基7-羟基香豆素基-2-酮苷作为荧光的底物在制备含少量培养的病毒以及一些从感染流行性感冒病毒的志愿者的鼻洗液样本的制剂中测量神经氨酸活性。Yolken等提示“成功地开发出用于检测流行性感冒神经氨酸酶的荧光度量酶分析方法，由此提供了能足够快地让合适的防治介入的诊断流行性感冒的实用的手段”根据Yolken等的方法，光量分析对临床应用灵敏度不足。相反，Yolken等注意到荧光分析可适用于检测出临床样本的流行性感冒神经氨酸酶。

Pachucki等(临床微生物学杂志(J.Clinical Microbiology)，26(1988)2664-2666)等试验了Neu5Ac的4-甲基7-羟基香豆素基(umbelliferyl)-2-酮苷对从流行性感冒病人收集到的临床样本的作用。由于其灵敏度低，分析没有在临床样本中直接迅速地检测到神经氨酸酶。但是，该分析在组织培养物培养25小时后识别出了91％的病毒阳性分离物。

使用修饰的Neu5Ac底物会增加神经氨酸酶分析的特异性。在唾液酸中，4-位碳(C-4)被报道在酶底物交互作用中起重要的作用。再者，由于唾液细菌酶有神经氨酸酶活性(Varki等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，258(1983)12465-12471)，必须消除这些不需要的交互作用。现已显示4-甲氧基-Neu5Ac的酮苷对某些细菌性唾液酸酶有耐受性，但，被某些病毒唾液酸酶快速地裂解(Beau等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.〕，106(1980)531-540)。

虽然对N-乙酰基神经氨酸的4-位修饰提供了特定病毒和特定细菌性神经氨酸酶反应活性之间的特异性，但仍然需要得到这样的底物：它让各种病毒的神经氨酸酶反应活性之间进一步有特异性或分化，同时保持病毒和细菌神经氨酸酶反应活性的特异性。例如，这类底物对特定类型的含神经氨酸酶病毒的特异性高，能有更好更多地直接治疗方式。这类底物也能更精确地监视病毒感染，得到更合适的集中医学治疗。本发明的显色和荧光4，7-改性的N-乙酰基神经氨酸底物使各种病毒神经氨酸酶反应活性之间有进一步的特异性或分化，同时保留了病毒和细菌神经氨酸酶之间的特异性。

发明综述