[发明专利]获得能够产生抗肿瘤分子的微生物的方法

说明书

技术学科

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及获得能够产生抗肿瘤分子的微生物的方法，所述微生物是在合适的宿主中以转化细胞反击微生物菌株期间获得的。

以前的技术

到目前为止没有报道过用于诱导微生物产生具有抗肿瘤潜力的分子的方法。

发明详述

microbiotic构成了生物技术重要性的潜在的生物活性化合物，它们在其它天然源不存在。本发明的新颖性在于用天然形式的或通过在实验室处理过的转化细胞在合适的宿主中反击任何来源的微生物菌株，从而在微生物和这些细胞之间产生拮抗作用，这种行为导致从微生物释放能够产生导致肿瘤细胞死亡的分子，这样产生了新的微生物突变体。

获得微生物突变体的主要步骤如下：分离和克隆能够在特定培养条件下突变的微生物菌株；用转化细胞进行反击，并且分离产生具有抗肿瘤活性的分子的突变菌株。将这些突变体在最佳培养基条件下进行生长并且产生上面提到的分子。

在体外检测中，利用鼠和人细胞证实所获得的制剂的抗增殖活性，利用动物模型体内证明其抗肿瘤潜力。

本发明的目的是研制用于获得能够产生抗肿瘤分子的微生物的方法，所述分子可用于治疗致瘤性疾病。

本发明的新颖性在于用肿瘤细胞在合适的宿主中反击微生物菌株。根据共培养8天可达到上述目的；然后使肿瘤样本退化，进行微生物学分析，直到发育产生微生物菌株的突变体克隆，并且根据其产生具有抗肿瘤活性的分子的能力进行识别。

为了利用本发明描述的方法获得抗肿瘤制剂，例如在1升蛋白胨-甘油培养基中，28℃，培养微生物突变菌株15小时，培养的同时进行光照和振荡。然后将培养液以12000g，4℃离心30分钟，去除上清液，随后在不同的孔径的滤膜上，在无菌条件下过滤，滤膜孔径最高达到0．2微米。

实施例1

获得微生物突变菌株

为了获得微生物突变菌株，使用粘质沙雷氏菌(ATCC 14756)并且以7-8周龄的重量为20-22克的雄性BALB／c小鼠作为宿主。用0．5毫升的重液体凡士林腹膜内(i．p．)注射接种这些小鼠。在10天之后，给小鼠腹膜注射鼠肿瘤细胞CB-HEP1(1×10⁶细胞／毫升，1毫升/小鼠)，以诱导腹水肿瘤，并且注射lcfu的上述微生物菌株。8天之后，回收腹水液体，进行微生物学分析，在所述腹水液中检测接种的微生物菌株的突变体。分离突变体菌株(图1和2)，命名为SM9056。

实施例2

突变菌株SM9056的培养和保存

培养物是在蛋白胨-甘油平板上，28℃生长的菌落的一部分，接种预培养物并且培养4小时(对数期为起点)。利用GRAM染色检测培养物的纯度(革兰氏阴性球杆菌)。借助于API20E试剂盒(bioMerieux)进行识别。

利用电子显微镜观察形态学特性(图3)。分析培养基和培养条件，直到建立产生重复生长曲线的最佳培养物(图4)并且保持表现型特性。

将SM9056菌株冷冻储存并且在脱脂牛奶中冻干以长期储存。

实施例3

抗肿瘤制剂

为了从前面描述的实施例分离的SM9056突变菌株获得抗肿瘤制剂，在1升蛋白胨-甘油培养基中，28℃培养所述微生物15小时，培养的同时进行光照和振荡。将培养液以12000g，4℃离心30分钟，去除上清液，随后在不同的孔径的滤膜上，在无菌条件下过滤，滤膜孔径最高达到0．2微米。然后利用10kDa截断膜将上清液体积降低10倍，在4℃，PBS中，生理条件下透析24小时。在无菌条件下将透析后的物质过滤，将5毫升物质分散于晶体apirogenic小管。将抗肿瘤制剂储存于4℃。

实施例4

利用体外分析对抗肿瘤活性进行评估

在不同的人和鼠肿瘤细胞系上，在下面的试验条件下，对抗肿瘤制剂的抗增殖或细胞毒性活性进行评估：

-鼠肿瘤细胞：P3X63Ag8骨髓瘤(KEARNEY，J．F．等人(1979)，免疫学杂志，123：1548-1550)

-CB-HEP1杂交瘤(FONTIRROCHI，G．，等人(1993)，生物技术应用10(1)：24-30)