[发明专利]印度水稻的转化方法

说明书

技术领域

本发明是关于使用土壤杆菌法对水稻进行转化的方法。

技术背景

对于水稻转化方法，已开发有通过原生质体的电击穿(エレクトロポレ-シヨ ソ)法和PEG法，使用的是容易培养的日本水稻。然而，这种方法，仅适用于由原生质体而来的分化系已经确定了的品种，对于培养困难的印度水稻，适用实例却很少。

粒子枪(パ-テイクルガン)法，由于不需要原生质体培养系统，所以作为适用于多种品种的新型转化方法，已在很多研究机构内广泛采用。一般认为印度水稻品种培养困难，但其中，占印度水稻中的大部分，称作groupl的品种群[Glaszmann J．C．(1987)亚洲水稻品种的同工酶和分类(lsozymes andclassification of Asian rice varieties)The or Appl．Genet．74：21-30]培养很困难。但是，利用Christou等人报导的粒子枪法[Christoup．Ford，T．L．andKofron．M(1992)用于水稻的各种独立基因转移法的进展(The deve lopment ofa variety-independent gene-transfer method for rice)TIB TECH 10：239-246]对Groupl品种的转化效率，未成熟胚芽低到2-3％，其他研究组近年来也报导，对于印度水稻没有获得高效转化系(LiL．Rongda．Q．Kochko A．，Fauquet，C．and Beachy，R．N．(1993)使用生物分解法的一种改进的水稻转化系统(An improved rice transformation system using the biolistic method)，PlantCell Report 12：250-255)。

另一方面，土壤杆菌法，对于双子叶植物，作为既简便又稳定的转化方法已得到广泛采用。但到目前为止，一直认为土壤杆菌法不适用于稻科等单子植物(Potryk US 1．，(1990)对禾谷类作物的基因转移(Gene transfer tocereals)an assessment Bio／technology 8：535-542)。近几年才明确，对于单子叶植物的水稻也可以进行转化(WO 94／00977；WO 95／06722；HieiY．，Ohta，S．，Komari，T．and Kumashiro．T．(1994)水稻的有效转化，(Efficienttransformation of rice)(Oryza Sativa L．)由土壤杆菌和T-DNA界面的序列分析所引起(mediated by transformation by Agrobacteri um and Sequence analysisof the boundaries of the T-DNA)The Plant Journal 6：271-282]，作为一种有用的转化方法期待着今后的研究发展。

另一方面，Rance等人公开了一种从印度水稻的成熟种子诱导具有再分化能力的愈伤组织(カルス)的有效培养基NB[lann M．Rance I．M．等人，部分干燥成熟胚衍生的愈伤组织，一种显著改进印度水稻再生能力的简便处理法(Partial desiccation of mature embryo-derived calli，a simple treatment thatdramatically enhances the regeneration ability of indica rice)plant cellReports(1994)13：647-651]。但是，关于筛选NB培养基对转化细胞的效果没有研究。使用粒子枪法，Li等人报导了使用类似于NB的培养基(不含有NAA，BA及L-谷氨酰胺)，对日本水稻具有很高的转化效率(Li L．等人，(1993)使用生物分解法的一种改进水稻转化体系(An improved ricetransformation system using the biloisticm ethod)Plant cell Report 12：250-255)。但是，也报导了，对于印度水稻不能有效地获得转化体。Li等人对这种培养基在土壤杆菌法中的适用性没有研究。

如上所述，运用原生质体的方法，存在的问题是对于不能由原生质体确立再分化系统的品种，因而不适用。就粒子枪法的报导而言，到目前为止，对于像印度水稻这样的培养困难的品种，转化效率仍很低。