[发明专利]检测真菌的材料及方法

说明书

                    技术领域

本项发明涉及用于检测各种真菌的核酸以及应用该核酸进行的各种真菌的检测方法。

                    现有技术

作为深部真菌病的主要病原菌包括假丝酵母属(Candida以下简称C.)真菌、曲霉属真菌(Aspergillus以下简称A.)、隐球酵母属真菌(Cryptococcus.以下简称Cr.)等。假丝酵母属的主要病原菌包括白色假丝酵母、乳酒假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母等；隐球酵母属的主要病原菌包括新型隐球酵母。在与假丝酵母属同样重要的病原菌曲霉属中，有关的病原菌包括烟曲霉、黄色曲霉、黑色曲霉、构巢曲霉、土曲霉等。可望有方法能对这些菌种迅速地检出、分类并鉴定。

近年来，深部真菌病在免疫功能不全的患者当中感染的机会增多了，但是这些患者多伴有危重的原发疾病，因此，早期明确致病菌并给予恰当的治疗是必要的。深部真菌病的诊断以血液培养方法为基本但在检出率方面还存在问题。至此，用于诊断的抗体已成为商品，但依据抗体进行诊断对免疫功能不全的患者不起作用。基于这种现状，近年来开发出了直接检测抗原及其他菌体成分的方法。例如依据甘露聚糖，D-阿拉伯糖醇、葡聚糖等的检验而诊断感染的方法。另外，随着分子生物学的发展，开发出了通过提取结核菌、衣原体等各种病原菌的DNA、即所谓的通过采用PCR方法等检出核酸而进行诊断的方法。在深部真菌病的方面，也提出了通过检测核糖体RNA进行诊断的方法(临床病理、43卷附册、119页、1995年)。

                     发明的公开

本发明的目的，旨在提供用于检测导致深部真菌病的病原菌即曲霉属真菌的核酸，并提供利用这些核酸而能简便、迅速、特异并且高敏感度地检测这些真菌的方法。

发明人，通过对各种真菌症的病原菌、特别是对曲霉属真菌的基因进行反复研究，把着眼点放在了存在于线粒体中的能引起各种真菌症的真菌的细胞色素b基因上，为了对基因进行部分扩增而合成了各种核酸。通过在那些核酸当中查寻能导致真菌的细胞色素b的基因扩增的引物，而发现了序列表中的序列号1-4的核酸。而且通过利用序列号1-4的核酸而对存在于线粒体中的细胞色素b基因进行部分扩增，而成功地解读了那些序列。发明人以那些序列为基础进行了反复研究，发现了曲霉属真菌的各种特异的序列，并以此为基础设计了不同特异的引物。例如，发现了作为烟曲霉的特异性引物在序列表中的序列号为10、65、68、69，黄曲霉菌的特异性引物的序列号为11、12、66、67，黑色曲霉菌的特异性引物的序列号为13、64、70、71，构巢曲霉菌的特异性引物的序列号为14、63、72、73，土曲菌的特异性引物的序列号为15、62、74、75。

通过提取能简便、迅速、特异并高度敏感地检测分类及鉴定曲霉属真菌的核酸，并据此建立起了应用该核酸的检验方法从而完成了本发明。进一步，利用含序列表序列号1及2表示的碱基序列的引物进行改良，并提供序列号为57所示的碱基配对的引物，由此除上述真菌外，使巴西果小克银汉霉(Cunninghamella bertholletiae)及卷枝毛霉的检测成为可能。