[发明专利]丝状真菌的形态突变体

说明书

本发明涉及具有改进的分泌重组多肽的能力的新真菌，以及改进这种分泌的方法。

丝状真菌已被确认为生产重组多肽的广泛应用的宿主细胞系统。然而，在很多情况下，具有所需的易转化性和异源多肽表达性状的真菌不一定具有最希望的成功发酵的特征。例如，发酵时的生长形态可能不是最佳的，因为当生物量增加时很多培养物变得十分粘稠。增大的粘度限制了使发酵培养物混合和通气的能力，导致菌丝体缺乏氧和营养，它反过来变得不能存活和非生产性的，限制目的多肽产率。另一方面，根据生产的酶量评价，显示良好发酵形态的丝状真菌菌株不一定是最好的生产菌株。因此，为了商用目的，需要这类丝状真菌宿主，即它们将表达工业量的重组多肽的能力与令人满意的生长特性(如迅速生长和低粘度)相结合，于是增强发酵时的生产能力。

筛选具有改进发酵形态的大量突变体相当困难，且形态突变菌株通常是基于固体培养基上的异常菌落形态而分离的。传统上，形态突变体一直是在含异源基因的多个拷贝的已转化菌株中分离的。然后分析突变体的发酵生长特性和异源基因表达。虽然该方法可能适用于鉴定改进的表达菌株，但任意特定的真菌生长形态与菌株生产大量分泌性多肽的能力之间的关系尚待确定。形态突变体有时也在已转化菌株的诱变之后在多肽表达改进筛选中回收，但对这些菌株的研究仍然未导致任何有关形态控制的有意义的认识。此外，含异源基因表达盒、亲代菌株的形态上“改进的”菌株不适合作一般的表达宿主，因为它们不能用于专门表达其它异源多肽。

本发明的一个目的是提供生产和鉴定用于异源多肽生产的有用形态突变体的方法。

本发明涉及从丝状真菌亲代细胞获得突变细胞的方法，该方法包括：(a)获得亲代细胞的突变细胞；(b)鉴定表现出比亲代细胞更受限的菌落表型和/或延伸更多的菌丝分枝的突变细胞；以及(c)鉴定突变细胞，当该突变细胞与亲代细胞在相同条件下培养时，该突变细胞比亲代细胞具有改进的生产异源多肽的性能。

本发明还涉及按本发明的方法生产的突变丝状真菌细胞。

本发明还涉及生产异源多肽的方法，该方法包括：(a)培养包括编码该异源多肽的核酸序列的、本发明的突变细胞；以及(b)回收该异源多肽。

图1示出pJeRS23的限制图。

图2示出对照菌株HowB425和菌落突变体JeRS316在PDA+尿苷固体培养基上的菌落生长。

图3示出在HowB425(对照物)和JeRS316(突变体)转化体中脂肪酶表达的分布示意图。

图4示出在HowB425(对照物)和JeRS317(突变体)转化体中脂肪酶表达的分布示意图。

图5示出对照菌株与突变菌株发酵时异源脂肪酶生产期的比较。

图6示出pCaHj418的限制图。

图7示出pDM148的限制图。

图8示出pDM149的限制图。

图9示出pJaL154的限制图。

图10示出pMT1612的限制图。

图11示出pJRoy30的限制图。

本发明涉及从丝状真菌亲代细胞获得突变细胞的方法，该方法包括：(a)获得亲代细胞的突变细胞；(b)鉴定表现出比亲代细胞更受限的菌落表型和/或延伸更多的菌丝分枝的突变细胞；以及(c)鉴定突变细胞，当该突变细胞与亲代细胞在相同条件下培养时，该突变细胞比亲代细胞具有改进的生产异源多肽的性能。

亲代细胞可用本领域已知方法诱变。例如，可通过辐射达到亲代细胞的诱变，如用UV、X射线或γ射线辐射亲代细胞。此外，可用化学诱变剂如亚硝酸、亚硝胺、甲基亚硝基胍，以及碱基类似物如5-溴尿嘧啶处理而达到诱变。最方便的方法是对亲代菌株的孢子应用诱变剂，并将存活的孢子铺在固体培养基上生长。还应懂得，突变体也可以是不存在特定的诱变方法时在群体中自然出现的变体，通过选择、筛选，或结合选择和筛选。例如参见，Wiebe等，1992，真菌学研究(MycologicalResearch)96:555-562以及Wiebe等，1991，真菌学研究95:1284-1288分离镰孢属(Fusarium)菌株A3/5的形态突变体。因此，本发明中的术语“突变体”还包括未有意应用诱变剂时的天然产生的变体或突变体，即自发突变体。