[发明专利]形成异源二聚体的杂种蛋白质

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种含有两个共同表达的氨基酸序列并形成一个二聚体的杂种蛋白质，该两种氨基酸序列的每一种含有：

(a)至少一种选自一种同源聚体受体(homomeric recedtor)，一种异源聚体的链，一种配体，及它们的片段的氨基酸序列；以及

(b)一种异源二聚体蛋白质类激素的亚单位或其片段；其中(a)和(b)是直接结合的或通过一种肽连接物结合的，以及在每一个双体中，两个亚单位(b)是不同的并能够聚集形成二聚复合体。发明背景

蛋白质-蛋白质相互作用对于细胞和多细胞有机体的正常生理功能来说是必不可少的。自然界中的许多蛋白质当与一个或多个其它蛋白质链相复合时，会表现出新的或最适的功能。这可通过各种配体一受体结合而对细胞活动的调节来说明。一些配体，如肿瘤坏死因子α(TNFα)，TNFβ，或人类绒毛膜促性腺激素(hCG)，是以多亚基复合体存在的。一些这种复合体含有多拷贝的同一种亚基。TNFα和TNFβ(下文统称为TNF)是由3个相同的亚单位形成的同源三聚体(1-4)。其它配体是由非同种亚基组成的。如，hCG是一种异源二聚体(5-7)，受体也可以多链复合体的形式存在或发生功能。如，TNF的受体在聚集形成二聚体时可传递一个信号(8,9)。这些受体的配体促进两个受体链的聚集，从而提供一种受体活化的机制。例如，TNF介导的聚集激活TNF受体(10-12)。

蛋白质-蛋白质相互作用的调节可以是各种疾病和病理中治疗介入的有用机制。可与配体相互作用的可溶性结合蛋白质可能会将配体与受体分离，从而减弱特定的受体途径的活化。或者，配体的分离可能推迟它的清除或降解，从而增长它的效应期间，并可能增强它在体内的表观活性。对于TNF，可溶性TNF受体已主要与TNF活性的抑制相联系(13-17)。

可溶性结合蛋白质对于治疗人类疾病来说可能有用。例如，可溶性TNF受体已显示出在关节炎的动物模型中有效用(18,19)。

由于TNF对其受体具有3个结合位点(10-12)，并且该细胞表面受体的二聚体化对于生物活性来说是足够的(8,9)，很有可能单个可溶性受体与TNF的结合将带来一种可能性，即可溶性受体：TNF(三聚体)的这种1∶3复合体仍可结合和活化一对细胞表面TNF受体。为获得一种抑制效应，期望TNF三聚体上的受体结合位点中的两个必须由可溶性结合蛋白质占据或封闭。或者，该结合蛋白质可在细胞表面上封闭适当定向的TNF。

总而言之，人们觉得需要合成含有两个受体(或配体)链的作为二聚体杂种蛋白质的蛋白质。参见Wallach等，美国专利5478925。用于产生含有来自胞外受体结合区域的二聚体或多聚体杂种蛋白质的策略为将这些蛋白质与抗体重链的恒定区段相融合。

这一策略导致了，例如，CD4免疫粘附素的构建(20)。它们是由与抗体的重链和轻链的恒定区段融合的CD4的前面两个(或全部四个)免疫球蛋白类区域组成的。这个创建杂种分子的策略被调整用于TNF的受体(10,16,21)，并导致了与单体可溶性结合蛋白质相比具有较高体外活性的构建体的产生。

人们普通认为，二聚体融合蛋白质较高的体外活性应当转化为较高的体内活性。一个研究的结果支持了这一论点，p75(TBP2)-Ig融合蛋白质在保护小鼠免于产生静脉内LPS注射的不良后果上显示出至少50倍高的活性。

但是，虽然免疫球蛋白融合蛋白质已得到广泛应用，这一策略具有几个缺点。一个是一些免疫球蛋白Fc区域参与免疫系统的效应物功能。这些功能在特定的治疗情形中可能是不期望的(22)。

第二个限制与期望产生异源聚体融合蛋白质，如异源聚体IL-6或Ⅰ型干扰素受体的可溶性类似物的特定情形相关。虽然有很多方法产生双功能性抗体(如，通过共转染或杂交瘤融合)，但通常情况下产生的同源二聚体和异源二聚体的混合物大大损害了合成的有效性(23)。最近已有几个报道描述了使用亮氨酸拉链基序引导异源二聚体的组装(24-26)。这好象是一个用于研究目的的有前途的方法，但所使用的这种非自身的或胞内序列由于其抗原性而不适合于临床上的长期使用。组装的效率和组装后的稳定性也可能是限制因素。