[发明专利]具有果胶酯酶活性的酶

说明书

                          发明领域

本发明涉及具有果胶酯酶活性的酶、编码具有果胶酯酶活性的酶的DNA构建体、产生酶的方法、包含所说的具有果胶酯酶活性的酶的酶组合物及所说的酶和酶组合物在许多工业应用中的用途。

                          发明背景

果胶聚合物是植物初生细胞壁的重要组分。它们由1,4-连接的α-D-半乳糖醛酸和其甲基化衍生物的链组成。利用果胶降解酶(如多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、果胶裂合酶或果胶酸酯裂合酶)对食品工业，主要在水果和蔬菜加工(如果汁的生产或酒的酿制)中是重要的，其中在水果和蔬菜加工中，利用这些酶催化降解果胶聚合物主链的能力。

为了许多目的，理想的是：提供各种果胶降解酶，例如，这些酶以不含其它组分的形式存在于包含许多不同果胶降解酶的商业制剂(这类制剂的例子是Pectinex Ultra SP^，从棘孢曲霉制备，由Novo NordiskA/S提供)中。按照这一点，将可能产生适应于特定的目的的酶制剂(如或包含一种单一的果胶降解酶或包含它们的任意结合物的酶制剂)。为此，利用重组DNA技术提供单一组分的果胶降解酶是方便的。

果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)催化甲醇从果胶除去，导致果胶酸(多聚半乳糖醛酸)的形成。

果胶甲基酯酶由许多微生物产生，并已发现存在于许多高等植物的叶、根、柄和果实中。微生物果胶甲基酯酶已由Khanh等(1990)，“从黑曲霉菌株RH5344分离的果胶酯酶的核苷酸及衍生的氨基酸序列”，核酸研究18:4262；Khanh等(1991)，“黑曲霉中编码基因组果胶甲基酯酶的基因的特征化和表达”，基因106:71-77；Spok等，(1991)，“青枯假单胞菌的果胶酯酶基因的分子克隆和测序”，微生物遗传学杂志137:131-140；Plastow(1988)，“菊欧文氏菌B374的果胶甲基酯酶基因的分子克隆和核苷酸测序”，分子微生物2:247-254；Laurent等，(1993)，“编码菊欧文氏菌菌株3937的果胶甲基酯酶pem基因的特征化和超量表达”，基因131:17-25；Tierny等，(1994)，“编码来自多形拟杆菌的果胶酸酯裂合酶和果胶酶甲基酯酶活性的基因的分子克隆和在大肠杆菌中的表达”，应用细菌学杂志，76:592-602。

WO 94/25575描述了来自棘孢曲霉的果胶甲基酯酶的克隆。

                           发明概述

按照本发明，发明人现已成功地分离并特征化来自担子菌门真菌的DNA序列，因此使制备单一组分的果胶酯酶组合物成为可能，其中，所说的DNA序列编码一种显示果胶甲基酯酶活性的酶，该果胶甲基酯酶也称为果胶酯酶。

因此，第一方面，本发明涉及一种DNA构建体，该构建体包含编码显示果胶酯酶活性的酶的DNA序列，此DNA序列包含：

a)克隆进存在于大肠杆菌DSM 10357中的质粒pYES 2.0中的DNA序列果胶酯酶编码部分，或

b)与a)中限定的DNA序列类似的序列，该序列

ⅰ)与a)中限定的DNA序列至少60％是同源的，或

ⅱ)与SEQ ID NO:1中位置4-933显示的DNA序列在严格性差的条件下杂交，或

ⅲ)编码一种多肽，该多肽与由包含a)中限定的DNA序列的DNA序列编码的多肽有至少50％的同源性，或

ⅳ)编码一种多肽，该多肽与针对纯化的果胶酯酶产生的抗体是免疫反应性的，其中所说的果胶酯酶由a)中限定的DNA序列编码。

编码果胶酯酶的全长cDNA序列已从丝状真菌Meripilus giganteus菌株获得，并已克隆进存在于大肠杆菌菌株DSM No.10357的质粒pYES 2.0中。

人们相信：所说的大肠杆菌DSM 10357中包含的编码果胶酯酶的DNA序列具有与SEQ ID NO:1代表的DNA序列相同的序列。因此，只要提及克隆进存在于DSM 10357中的质粒pYES 2.0中的DNA序列的果胶酯酶编码部分，也旨在于包括SEQ ID NO:1代表的DNA序列的果胶酯酶编码部分。

因此，术语“克隆进存在于DSM 10357中的质粒pYES 2.0中的DNA序列的果胶酯酶编码部分”和“SEQ ID NO:1代表的DNA序列的果胶酯酶编码部分”可互换。