[发明专利]晶态蛋白酶及其生产方法

说明书

本发明涉及蛋白酶在高于10℃的温度下的结晶。更具体地说，本发明涉及应用硫酸钠在水溶液中进行蛋白酶的选择性结晶。

大量研究工作致力于将沉淀和结晶酶作为纯化和制备酶产品的方法。例如，在美国专利No.4,659,667中公开了从溶液回收酶的一种方法，该方法通过在该酶的等电点附近的pH下将含有该酶的溶液浓缩成过饱和，诱导结晶，再回收结晶的终产物。诱导结晶是通过在浓缩下或通过放入晶种、声音、搅拌或刮擦容器内表面使酶自发地结晶而完成的。例如α淀粉酶的结晶。

在PCT出版物No.WO89/08703中描述了枯草蛋白酶的结晶方法，该方法是将卤化物盐如氯化钠或氯化钙加入至少约40克/升的浓缩了的枯草蛋白酶溶液。

在EP506,866中公开了酶的一种结晶方法，其特征在于：将含有较高酶纯度的液体的水溶液作为原材料，该溶液中酶的浓度至少约为5克/升，并加入非卤化物型的易溶性盐作为结晶剂，结晶剂的浓度大大低于沉淀呈无定形的该酶所需的量。例举了在高达30℃的温度下一些枯草蛋白酶的结晶。硫酸钠被用于帮助纯化蛋白酶产物而不是用于结晶作用。

尽管在酶结晶领域中已有这些进展，但适合大规模生产的、花费不多且有效的蛋白酶结晶方法在工业中仍成问题。应用室温和廉价盐在工业规模结晶蛋白酶的能力将意味着大大的节省而且对工业会有很大重要性。

本发明的一个目的是提供结晶蛋白酶的简单、低成本的方法。

本发明的一个实施方案提供了结晶蛋白酶的方法，该方法包括：(a)制备含该蛋白酶的水溶液；以及(b)将包括硫酸钠的一种盐加入该水溶液，其中所述步骤(b)是在10℃和60℃之间的温度下进行的。

通过实施本发明，有可能在短时期内获得高度纯化的晶态蛋白酶产品，它具有不寻常的成品特性。实际上，通过优化本发明的条件，常可能获得大于50％的稳定产率，且在特别优选的一个实施方案中，在5小时内产率大于70-80％。该结果对工业有很大价值。

而本发明的另一个优点是结晶过程发生很迅速。与通常需要多到2-3周使酶结晶的许多现有技术相比，本发明在少到5小时内生产高产率的、高度纯化的蛋白酶晶体。

此外，本发明的方法容易放大到工业水平。

“蛋白酶”表示具有蛋白酶解活性、常见于酶分类3.4中的蛋白质。可按本发明方法结晶的蛋白酶包括：丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、羧基蛋白酶或酸性蛋白酶、以及金属蛋白酶。

在本发明的一个优选的实施方案中，提供了结晶蛋白酶的方法，该方法包括：制备含所述蛋白酶的水溶液，再将包括硫酸钠的一种盐加入所述水溶液，其中该水溶液处于约10℃和60℃之间的温度下。

本发明的蛋白酶可得自任何生产蛋白酶的微生物。优选按本发明方法结晶的蛋白酶得自细菌、真菌、植物和动物来源。更优选地，细菌蛋白酶得自芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)，包括解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)，高温单孢菌属菌种(Thermomonospora sp.)，假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)，梭菌属菌种(Clostridium sp.)，链霉菌属菌种(Streptomyces sp.)和微球菌属菌种(Micrococcus sp.)。本文应用的术语“芽孢杆菌属”或“芽孢杆菌属菌种”指以前被归类为芽孢杆菌属或目前被归类为芽孢杆菌属的任何细菌菌株。优选的真菌蛋白酶可得自曲霉属菌种(Aspergillus sp.)或木霉属菌种(Trichodermasp.)。优选的动物蛋白酶得自牛类。

得自DNA序列的基因修饰的蛋白酶也被认为属于本发明的范围，在该DNA序列中蛋白酶的一个或多个氨基酸已被缺失、替换或被其它方法处理过。这类修饰的蛋白酶例如被描述于PCT出版物No.WO95/10615和美国专利5,185,258中。

培养细胞和生产蛋白酶的发酵方法是本领域中本来已知的。例如，蛋白酶可通过固体培养或深层培养生产，包括间歇法、补料分批法和连续流动法。从发酵液收集并纯化蛋白酶也可通过本领域本来已知的方法进行。