[发明专利]用于鉴定与部位偏爱性癌转移形成有关的基因的免疫-磁性细胞分离技术

说明书

本发明的目的是提供一种新颖的技术，用于检测存在于不同组织的肿瘤细胞中的具有部位特异性表达模式的新基因。

众所周知，很多类型癌表现出典型的扩散模式，因此此过程中，转移通常有序地优先出现在某些组织或器官中。例如，乳腺癌的转移通常首先在腋下淋巴结中形成，而骨髓和骨转移是首先最常见(50％)的远隔扩散部位。其它组织中，肝，肺和中枢神经系统(最高达20％)也成为乳腺癌转移的宿主。类似地，前列腺癌表现出骨髓转移，结肠癌扩散至淋巴结和肝脏，骨肉瘤扩散至肺，恶性黑素瘤扩散至淋巴结，肝、肺和脑，对于决定这种组织偏爱性癌扩散的因素所知甚少，但是肯定涉及肿瘤细胞的神经特征，借助于例如，使肿瘤细胞能寄宿于靶器官，能转移并侵入宿主组织，能应答于当地的生长因子，能诱导血管形成，或者通过其它迄今未知的方式起作用。这些特征必定同已知或未知基因表达的的特定蛋白质表达相关连。因此，鉴定这样一些基因，对于了解转移的机理，并从而对诊断和治疗提供新的指导或线索具有重要的意义。

有几种方式正在用于研究在某些细胞群能高度表达、而在其它细胞群不能表达的基因，包括例如扣除杂交克隆技术，以及应用差示显示法(differential display)。这些克隆方案的绝大多数都涉及使用体外细胞株，或者使用克隆作为起始物。但是，已经知道，这些细胞株可能明显不同于产生它们的肿瘤细胞，并且体外培养条件下也可能增量或减量调节涉及决定细胞侵入细胞外基质和基质组织的能力，以及它们的总体转移能力的基因的表达。

用于比较基因转录物或所需蛋白质表达的细胞株的另一种合理的选择是使用来自病人原发肿瘤和转移肿瘤的肿瘤组织样品。但是，这种方法的确包括几种错误的可能性，并且还存在技术困难，当使用来自不同病人的肿瘤细胞时，在对与本研究有关的基因表达模式进行比较之前，必须扣除体现每个病人特征的基因表达。这就使这种基因克隆增加了极大的复杂性。因此，能够对从位于同一个病人不同部位的肿瘤表现形式得到的癌细胞比较其表现形式将是有利的。通过如下方式收集肿瘤组织可达到此目的：从原发性肿瘤和经检查并作外科手术切除的明显转移收集，和/或者通过对复发病人外科手术或活组织检查收集，或者从病人的继发性肿瘤收集，这些病人在初次外科手术之后已接受或未接受其它方式的治疗。

在任何一种基因克隆方案中，重要的是使用尽可能纯的靶细胞群，力图避免来自非靶细胞的、混淆待比较表达模式的无关信号。对于来自实体瘤的样品这点难以达到，因为在外科手术和活检样品中，肿瘤细胞是与正常的包括基质细胞和内皮细胞的纤维组织相混合的，常规的组织制备法不能满意地除去这些细胞。对于血液癌，其恶性细胞具有与相应的正常细胞亚群共同的抗原决定簇，这将阻碍对这二种类型细胞的分离。

在试图对早期肿瘤扩散中涉及的基因进行鉴定时，重要的是当继发性肿瘤的体积很小时从相关部位取得肿瘤细胞，或者如果有可能，甚至应该从亚临床肿瘤病灶或细胞中取得肿瘤细胞。一个实施例是，在常规的诊断检查能发现实体转移形式之前，恶性细胞已存在于血液或骨髓中。另一个实施例是在常规的形态学方法能够检测癌细胞之前，这些细胞已存在于脑脊液中，尿中，或者胸腔和腹腔渗漏液中。并且，在初次外科手术时，或者如果怀疑存在转移性扩散，淋巴结常常被除去，因为它们已扩大了。但是，当可能仅存在有限数量的肿瘤细胞时，形态学检查可能仍然是阴性。在所有这些实施例中，本发明描述了一种以基因克隆为目的的检测和选择靶细胞的方法。

除了使用从病人不同组织或器官得到的癌细胞之外，本发明还描述了另一种得到转移性人肿瘤细胞的途径，用于研究具有部位特异性表达的基因。已经在体外，或者在免疫缺乏的动物体内培养了来自几种人肿瘤的细胞，并且，用这些细胞建立了实验性转移模型，或者使细胞能在其中常位生长，即在临床相关的起源组织中生长的模型，如恶性黑素瘤在皮肤中，骨肉瘤在骨中，结肠癌在肠壁中，乳腺癌在乳房脂垫中，等等。在实验性转移模型中，可见到肿瘤扩散的不同模式，取决于细胞株，细胞注射的途径，以及所用宿主的种类。通常这种转移模式模拟相应种类的肿瘤在临床条件下的转移模式。通过使用这种模型，还可能从通常在病人体内不易进入的转移部位得到肿瘤细胞，例如脊髓和脑组织。而且，重要的是为了进行基因克隆，从动物细胞中选择人肿瘤细胞，从而避免了正常宿主细胞的基因表达问题。