[发明专利]多能性兔胚胎干(ES)细胞系及其在嵌合兔的产生中的应用

说明书

本发明涉及新的兔胚胎干(ES)细胞系及其在嵌合兔的产生中的应用。

基因打靶〔通过在胚胎干(ES)细胞中同源重组〕技术允许以所需的和规定的方式操纵基因(Capecchi,1989；Robertson,1987；Bradley,1987)。简要地说，将目的基因整合到质粒转移载体中，并通过用编码可选择标记的外源DNA置换其部分序列(失活)或通过突变的基因序列(靶诱变)来改变。然后这些已失活或突变的基因被导入ES细胞(每个细胞都具有发展成完整动物的潜力)。接着在体外筛选天然基因被失活的杂合体替代的ES细胞的克隆，筛选出的这些克隆被导入重新植入的正常胚胎中。此过程产生嵌合动物，这些动物筛选出来用于失活基因的种系传递。经过繁育和选择，于是产生了目的基因缺失(“敲除”)的转基因动物。

利用最近发展的技术使野生型或突变ES细胞和四倍体胚胎凝聚可以产生ES细胞完全衍化的小鼠(Nagy et al.,1993)。选择性地，ES细胞通过非同源重组，可以用于遗传物质的导入，允许在活着的动物中进行遗传改变的研究。

将转基因技术和ES细胞技术应用于基因功能的变化已经提供了一些重要人类疾病的动物模型(综述参见Wilson,1996；Rubin和Barsch,1996)。然而目前这项技术仅在小鼠中是成功的。尽管对于许多应用，小鼠是有用的，但是有一些明显的限制(例如大小限制和不能产生人类的疾病)限制了其潜在的应用。因此检测表型结果或功能丢失突变的较大动物模型将是非常有价值的。

确认的多潜能ES细胞已在许多其它物种中得到分离，包括仓鼠(Doetschman等，1988)，猪(Evans等，1990；Piedrahita等，1990；Notarianni等，1990；Talbot等，1993)，绵羊(Notarianni等，1990)，牛(Evans等；Saito等，1992)，水貂(Sukoyan等，1993)，兔(Graves和Moreadith,1993)，大鼠(Iannaccione等，1994)，人(Bongso等，1994)和灵长类(Thomson等，1995)。然而仅在小鼠和大鼠中已建立重新导入囊胚后在培养物中产生嵌合体的ES细胞，而到目前为止在兔和其它物种中的所有努力都已失败。

来自兔囊胚的新鲜的内细胞团(ICM)细胞已表明在注入受体囊胚后允许嵌合兔的产生(Gardner和Munro,1974；Moustafa,1974；Babinet和Bordenave,1980)，另外Yang等，(1993)已报道从新鲜分离的ICM及体外培养3天的ICM细胞中产生嵌合兔。

然而，为在ES细胞中通过同源重组允许基因打靶，能够在培养中保持更长时间并且具有已证明的产生嵌合动物潜能的细胞系对于产生目的遗传改变的后代是必需的。在本发明之前，除了小鼠和大鼠之外没有这样的别的动物的细胞系得到分离。

确认的多潜能的兔ES细胞的衍化以前由Grave和Moreadith报道过(1993)。在移出的胚胎连续传代以后出现了两种主要细胞类型。一种类型具有与滋养外胚层的初级赘疣相同的形态，细胞对胚胎的植入负责。第二种类型呈现典型的上皮样，被认为代表兔ES细胞(图1)。尽管这些确认的ES细胞能够产生胚胎样体(由代表外胚层，中胚层和内胚层的多种细胞类型组成)，但是它们在把上皮样细胞导入来源于新西兰白种(NZW)的囊胚后〔Grave和Moreadith,1993；Grave和Moreadith,未发表的结果(表1)〕，或者把细胞核转移进去核的新西兰白受精卵后(Du等，1995)不能产生嵌合兔。这表明用这些ES细胞不能产生嵌合体可能由于种的障碍。但是表1的数据表明从四个检测的上皮样细胞系中没有嵌合动物产生，每一个所测上皮样细胞系来自单个内细胞团。