[发明专利]组织纤溶酶原激活物(tPA)的纯化

说明书

发明领域

本发明涉及蛋白质纯化领域，尤其涉及的是用于组织纤溶酶原激活物(tPA)纯化的亲和配体的发现及分离。

发明背景

人组织纤溶酶原激活物或称tPA是一种由内皮细胞产生的对包含在血的凝聚体(即血块或血栓)中的血纤蛋白具有高亲和性的蛋白酶。tPA也用于激活并将纤溶酶原(一种无活性的蛋白酶原)转化成纤溶酶(一种溶栓酶)。由于tPA可与血栓中的血纤蛋白结合并激活纤溶酶原从而溶解血块，因此，tPA成为用作溶栓酶)。由于tPA可与血柱中的血纤蛋白结合并激活纤溶酶原从而溶解血块，因此，tPA成为用作溶栓剂的重要药物。

尽管tPA已作为治疗血栓的主导药物，但其它有效的溶栓剂如链激酶、尿激酶仍有竞争性，因为它们虽然疗效较低但费用却低得多。为使tPA保持为最对症处方的溶栓剂或可分发给更多患者，只有探寻一条途径使tPA的生产更为高效或费用更低。

在tPA的生产中，从生产原料流中消除杂质如细胞碎片、病原体，非人蛋白质等的有效方法也是非常重要的，这是因为任何蛋白质产物最终都是给予人类患者。

这样，在更高效及更经济的基础上，需进一步探求用于tPA分离的试剂、物质及技术。

亲和层析是一种可获得显著一步增高纯度的非常有效的方法。如Narayanan(1994)报道了通过一步亲和层析使纯度提高了3000倍。

但亲和层析不是在大规模生物分子生产中所通用的技术。理想的亲和层析配体必须是在适当的费用基础上：(1)可以高亲和性、高容量、高特异性及高选择性捕捉靶生物分子；(2)不捕获其它分子(杂质)或可使其它分子(杂质)差异洗脱；(3)在保护靶分子(即不降解或不变性)的条件下使靶分子控释；(4)可清洁和重复使用层析基质；(5)可消除或使一些病原体灭活。但发现要提供能在药物生产中耐受所要求的清洁及环境卫生的适当费用的高亲和性配体很困难(参见Knight,1990)。

鼠单克隆抗体(MAb)已被有效地用作亲和性配体。但另一方面单克隆抗体生产费用很高，且易于在与生物分子纯化相关的清洁及消毒过程中滤掉及降解，导致基于MAbs的亲和性基质很快失去活性(见Naraganan,1994；Boschetti,1994)。另外尽管MAbs对靶分子有高特异性，但该特异性通常不能有效地防止与靶分子密切相关的杂质的捕获。此外，MAb的结合特性可通过免疫动物的免疫球蛋白的所有组成成分来检测，且因此业者必须满足于由动物免疫系统所供的结合特性，即只使用MAb技术优化或选择特定结合或洗脱特性的机会很小。最终，每个MAb的结合位点(25Kda～75Kda)甚至MAb片段的分子量非常高。

至今为止，还没有适于tPA纯化的接近上述理想的亲和配体特性的已知亲和配体。这种亲和配体不仅要与靶tPA分子具有高亲和性，也要在所需或选择的条件下释放tPA，并能在tPA存在的溶液中将tPA与其它组分区分出，和/或能耐受清洁及消毒过程以提供可再生的再利用的层析基质。

本文提供了如此的亲和性配体及其获得方法。

发明概述

本发明提供了呈所需或所选择的结合特性及释放特性的tPA亲和配体的获得方法。本发明的亲和配体不仅具有亲和分离tPA的有利的结合特性，也具有所需的释放(洗脱)特性及其它所需特性如稳定性、耐降解性、持续性、再利用性及易于生产。

本发明的tPA亲和配体最初可从肽文库如噬菌体展示文库经以下方法鉴定：

(a)选择第一种溶液条件(即结合条件)，在此条件亲和配体可与tPA结合；

(b)选择第二种溶液条件(即释放条件)，在此条件tPA与亲和配体的亲和复合物将解离，其中第二种溶液条件不同于第一种溶液条件；

(c)提供一候选结合功能域的类似物文库，其中每个类似物与所述候选结合功能域不同之处在于功能域内一个或多个氨基酸位置的氨基酸序列的改变；

(d)将所述类似物文库与tPA在第一溶液条件下接触足够时间以使类似物/tPA结合复合物形成；

(e)除去在第一种溶液条件下未与tPA结合的类似物；

(f)将接触步骤(e)的溶液条件转变成第二种溶液条件；

(g)在第二种溶液条件下回收释放的候选结合类似物，其中回收的类似物即为分离的亲和配体。

在此一般程序之后，一些tPA的多肽亲和配体被分离，详见下述。

附图简述