[发明专利]用于生产小籽或无籽果实的遗传构建体和方法

说明书

发明领域

本发明涉及植物分子生物学领域，特别是转移基因植物，种子和组织，它们已经遗传修饰在授粉后产生无籽果实和蔬菜的植物。

发明背景

长期以来，无籽果实和蔬菜成为生产领域的目标。这些植物由于容易制作和食用这些产品，消费者的需求很大。还具有更甜，更新鲜的水果或蔬菜，并因为不含籽或籽腔很小增加了可食用部分。在这一领域中取得若干进展，通常利用局部应用激素或高度复杂的育种过程，这两种方法能产生三倍体基因型。

长期以来，局部应用赤霉素生产无籽葡萄。这种方法通常需要复杂喷洒过程，依赖于天气，并且在授粉之后准确按时进行。

另一个方法是在生产无籽西瓜时要求的复杂育种过程。西瓜中的无籽特征几乎是在每个细胞中存在三个同源染色体而不是两个的结果，称为三倍体。种子发育由于不平衡的胚胎、胚乳的基因组构成、不规则的减数分裂和配子形成而终止。异常的胚胎形成导致种子在早期终止正常的胚珠发育。通常无籽西瓜含有与未成熟的黄瓜一样小的可食用的白色胚珠。

通过每个细胞含有22个染色体的雄性二倍体(2X)系和每个细胞含有44个染色体的雌性四倍体(4X)系杂交产生这些三倍体种子。通过4n～2n杂交产生三倍体基因型，3n种子是“正常”的，并通过种植生长。三倍体植物是真正的F1杂交品种，所以它们的产生取决于二倍体和四倍体亲本系的发育。为了大规模地进行商业性生产三倍体种子，以混杂方式种植四倍体和二倍体亲本系，允许交叉授粉。三倍体种子只在用二倍体花粉授精的四倍体植株上的西瓜中产生。3n西瓜的生产田有二倍体授粉者。一些3n植物产生非常少的花粉，并且二倍体花粉获得无效授粉。由于总体的不平衡，种子发育在授精后终止。所以为了产生大量混杂的植物群，必须得到充足的二倍体和四倍体种子。生产这一类型的无籽西瓜的主要限制是难于产生足够的四倍体4X亲本系的种子。

通常这是通过使用秋水仙素完成的。秋水仙素抑制有丝分裂的纺锤体的形成，导致细胞含有不同数目的染色体。四倍体是通过每天在二倍体秧苗的顶端滴一滴0.2～0.4％的秋水仙素水溶液产生的。使用秋水仙素处理经常导致秧苗或种子的死亡，或产生非整倍体(含有额外或丢失染色体的细胞或多倍体)。

当一个需要的品种得到鉴定，染色体数目成倍增加后，通过自花授粉产生适当的种子。但是，对于大批量商业用途产生四倍体种子是非常困难的，主要因为四倍体表现出高度的自花不育。所以，在四倍体植株的田间很少有西瓜长成。在每个自花授粉的瓜中产生的四倍体亲本中结出种子更加困难。通常需要十年以上将新的四倍体系的种子数目增加到商业上可接受的数目。

Dennis Cray等人的美国专利第5,007,198号公开了提高西瓜四倍体亲本系的生产方法，该方法允许使用独特的组织培养技术克隆品种以克服四倍体细胞的不育性。通常，该方法利用组织培养繁殖方法，通过将茎分生组织用作繁殖的起始组织在充满营养和生长调节剂的培养皿中繁殖西瓜尖，“克隆”4n亲本，导致一个尖抽条15个茎。依次将茎用于抽条，进一步培养，使其呈几何体积增加。

在国际专利WO91/09957中公开了产生无籽果实的转移基因方法，它包括高度复杂的重组切除系统，称为“CRE-LOX”。通常，CRE的基因产物产生蛋白重组酶，作用于特异的LOX DNA序列。公开了几个重组功能，不变的在LOX DNA序列切除。本申请提出无籽西瓜是在包括用起源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloiquefaciens)的芽孢杆菌RNA酶基因转化的条件下发生的。通常，雌性含有种子包衣特异启动子(SC):CRE：终止子，雄性含有SC启动子：芽孢杆菌RNA酶基因：：Iox：：芽孢杆菌RNA酶基因：终止子。当繁殖时，在两个亲本间没有发生表现型的变化，并且在种子生产田间，雌性种子亲本具有正常的种子因为两个基因不会在同时发生作用(种子包衣仅仅是母本组织)。但是，在F1代中，母本组织将含有两个基因。在这一构型中，种子包衣的构成(F1植物，F2种子)是SC启动子：芽孢杆菌RNA酶基因：：-：：芽孢杆菌RNA酶基因：终止子，其中：：-：：代表切除Iox基因，产生特异于种子包衣的功能性毒素基因的点。在理论上，如果种子包衣破裂，由于流入胚胎的营养缺乏，种子的发育将终止。

目前尚无公开的实验数据，或已提议的方案在真正的无籽西瓜培育方面显示成功的例子。

由此可知，本领域需要简单，直接和容易重复的无籽果实和蔬菜的生产方法。

本发明的一个目的是提供表达构建体，当该构建体在转移基因植物中表达时，产生无籽果实和蔬菜。