[发明专利]酶的直接电化学

说明书

本发明涉及到酶的电化学，特别是羟化酶的电化学。

羟化酶是许多底物氧化时的催化剂，例如甲烷单加氧酶就是甲烷被分子氧氧化成唯一产物甲醇的有效催化剂。

文献中已有对羟化酶结构及电化学机理的研究报道。

甲烷单加氧酶有二种形式，可溶型(sMMO)和颗粒型(pMMO)。荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)中的可溶型酶包括一个羟化酶(250.5 kDa)，一个还原酶(38.5 kDa)，及一个调节组分，蛋白B(15.9 kDa)，三种成分都是活性所必需的。羟化酶由两个处于a262g2排列中的助催化剂组成，并且其X-ray晶体结构也已解出。发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)OB3b中的可溶性的甲烷单加氧酶也有相似的结构。对其了解得也较为清楚。sMMO的活性中心是位于羟化酶亚基中的双铁中心，当酶处于静息态时，两个铁离子由一个酰位羟基连接起来。NADH中的还原力通过还原酶中的F₂S₂和FAD中心转移到活性中心。蛋白B不含铁离子或辅基，其调节作用细节仍不清楚。当酶处于静息态时，铁离子处于高铁状态(Fe(Ⅲ)Fe(Ⅲ))，该双铁中心还有两种氧化状态，即混合价态(Fe(Ⅲ)Fe(Ⅱ))和全部亚铁状态(Fe(Ⅱ)Fe(Ⅱ))。正是羟化酶的亚铁状态在反应中与O₂反应，激活O₂。

荚膜甲基球菌(Bath)和发孢甲基弯菌OB36中双铁中心的氧化还原电势已经三家独立的研究测出。Fe(Ⅲ)Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅲ)Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)Fe(Ⅱ)/Fe(Ⅱ)Fe(Ⅱ)电偶的Eo′值是一些争论的焦点。从这二种不同微生物来源的sMMO已经研究得很透彻了。以前的研究用氧化还原指示剂滴定法和分光光度法来确定还原态的浓度。本研究中使用了具有氧化还原活性的介体(mediator)对羟化酶中的双铁中心进行了间接滴定，混合价态和全亚铁状态羟化酶的浓度用EPR或EPR加极低温Moessbauer光谱法测定(4.2-18°K)。

在蛋白电化学领域，含巯基或二硫键的有机化合物被发现是极好的修饰剂。因为它们可以通过很强的gold-surfer键进行化学吸附，因此可以在电极表面形成一层稳定覆盖物，相关氨基酸也可以以这种方式进行化学吸附，提高了电极表面的电化学能力。已经有人对使用含巯基及功能氨基酸(如Arg,lys,his)的多肽作为蛋白电化学的促进剂进行了研究。

然而，与蛋白化学领域相反，不借助介质对氧化还原酶进行直接电化学测量并非一件微不足道的小事。一个主要的困难是氧化还原中心常埋在蛋白内部，远离表面，电子必须迁移很长的距离才能到达电极以致于电子迁移速率降低至可忽略的水平。同样，大部分氧化还原酶比非氧化还原酶大，结构更松散，在电极表面它们更易于发生形变，失去活性。

羟化酶的电化学在有介体存在时变得复杂化了，因为羟化酶和介体之间可能会有相互作用，当温度与酶反应温度不同时，介体可能会影响浓度的测定。

避免上述不足是本发明的一个目标。

根据本发明的一个方面，本发明是在一个电化学过程中电极和酶之间的电子转移包括使酶吸附在电极上的方法。

这种转移优选是直接的。

根据本发明的另一个方面，酶的电化学方法包括不需要介体的直接电化学。

在本发明的一个实施方案中，这个酶是单加氧酶。

在本发明的另一个实施方案中，这个酶是P450或修饰后的P450。

本发明的另一个实施方案中，这个酶是甲烷单加氧酶。

本发明的另一个实施方案中，这个酶是羟化酶。

这个羟化酶可能是可溶的甲基单加氧酶。

这个酶可能包含一个以双铁离子为中心的活性位点，或者这个酶包含一个含卟啉的活性位点。

优选这种电化学过程中使用修饰过的金电极。

根据本发明的另一方面，修饰电极使之适于无介体时进行酶的电化学的过程包括用肽处理电极。

优选这种酶是单加氧酶。

这个酶有双铁或含卟啉的活性中心是合适的。

这个肽包含一个六肽是方便的。

优选地这个六肽包含cys和lys。

这个六肽是lys-cys-thr-cys-cys-ala是合适的。

方便的话，这种处理包括在六肽溶液里进行伏安循环(cycling)处理电极，同时避免电极的还原清洗。

根据本发明的另一个方面，底物在分子氧在有酶存在的情况下发生氧化的过程包括在无介体情况下发生的直接电化学。