[发明专利]具有齿斑葡聚糖酶活性的重组酶

权利要求书

1．构建包含得自适于异源生产的丝状真菌的齿斑葡聚糖酶基因的表达载体的方法，该方法包括以下步骤：

a)从丝状真菌中分离编码齿斑葡聚糖酶的DNA序列；

b)在编码前肽和齿斑葡聚糖酶成熟区的DNA序列之间导入Kex2位点或Kex2样位点，或用包括另一种真菌酶的Kex2或样位点的(前)原序列取代齿斑葡聚糖酶(前)原序列；

c)将步骤b)中得到的DNA序列克隆到适当的表达载体中。

2．根据权利要求1的方法，其中齿斑葡聚糖酶得自木霉属，较好是T.harzianum种的菌株，特别是T.harzianum CBS 243.71菌株。

3．根据权利要求1的方法，其中齿斑葡聚糖酶的DNA序列分离自T.harzianum CBS243.71的核酸文库，或是基于该文库生产的。

4．根据权利要求1至3中任何一项的方法，其中齿斑葡聚糖酶(前)原序列被Lipolase^(前)原序列或TAKA淀粉酶(前)原序列所取代。

5．包含齿斑葡聚糖酶基因和编码前肽之DNA序列的表达载体，其中在编码所说的前肽和齿斑葡聚糖酶成熟区的DNA序列之间有Kex2位点或Kex2样位点。

6．根据权利要求5的表达载体，其进一步包括可操作地连接的启动子序列和/或前原序列。

7．根据权利要求5和6的表达载体，其中前原序列包括原始齿斑葡聚糖酶信号序列，或Lioplase^信号序列，或TAKA原序列和带有Kex2或Kex2样位点的原始齿斑葡聚糖酶原序列，或Lioplase^原序列，或TAKA原序列。

8．根据权利要求7的表达载体，其中启动子是TAKA启动子或TAKA:TPI启动子。

9．根据权利要求5至8中任何一项的表达载体，其为载体pMT1796。

10．用于生产衍生于丝状真菌的重组齿斑葡聚糖酶的丝状真菌宿主细胞是木霉属真菌，如T.harzianum的菌株，或曲霉属真菌，如米曲霉或黑曲霉，或镰孢属真菌，如尖镰孢、禾谷镰孢、硫磺镰孢、五谷镰孢的菌株。

11．根据权利要求10的宿主细胞，其中宿主细胞是蛋白酶缺陷的蛋白酶-菌株。

12．根据权利要求11的宿主细胞，其中宿主细胞是缺失了称为“alp”的碱性蛋白酶基因的蛋白酶缺陷型菌株米曲霉JaL125。

13．在宿主细胞中生产重组齿斑葡聚糖酶的方法，其包括以下步骤：

a)将含有齿斑葡聚糖酶基因，并在编码前肽和齿斑葡聚糖酶成熟区的DNA序列之间有Kex2位点或Kex2样位点的表达载体转化到适当的丝状真菌宿主细胞中。

b)在允许表达和分泌活性齿斑葡聚糖酶的条件下，在适当的培养基中培养宿主细胞。

c)从培养基中回收并酌情纯化被分泌的活性重组齿斑葡聚糖酶。

14．根据权利要求13的方法，其中重组表达载体是按权利要求1至4的方法制备的。

15．根据权利要求13和14的方法，其中丝状真菌宿主是根据权利要求7至9中任何一项的宿主细胞。

16．按照权利要求13至15中任何一项的方法生产的分离重组齿斑葡聚糖酶。

17．从基本上没有任何污染物的Trichoderma harzianumCBS243.71得到的实质上纯的野生型齿斑葡聚糖酶。

18．含有根据权利要求16的重组齿斑葡聚糖酶或根据要求17的实质上纯的野生型齿斑葡聚糖酶，以及常规用于食物、饲料和/或宠物食品中的其他成分的组合物。

19．含有根据权利要求16的重组齿斑葡聚糖酶或根据权利要求17的实质上纯的野生型齿斑葡聚糖酶，进一步含有选自葡聚糖酶、氧化酶、过氧化物酶、卤过氧化物酶、漆酶、蛋白酶、内切葡糖苷酶、脂酶、淀粉酶及其混合物的酶的口腔保健组合物。